Методы выявления спор у бактерий

Методы окраски спор бактерий

Споры имеют вид образований округлой или овальной формы, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное — спора находится в центре тела микроба; субтерминальное — спора располагается ближе к одному из ее концов; терминальное — спора располагается на конце палочки. Диаметр споры может не превышать диаметра тела микробной клетки, и форма палочки при спорообразовании не изменяется (бациллы). В других случаях диаметр споры больше поперечного размера микробной клетки, и тело ее в месте образования споры утолщается (клостридии).

Форма, величина и расположение спор постоянны для каждого вида бацилл. В отличие от вегетативной части клетки, споры содержат значительно меньше свободной воды и большое количество липидов и кальция. Плотная оболочка спор, непроницаемая для воды, окрашивается с большим трудом, поэтому при обычных методах окраски споры имеют вид неокрашенных пустот внутри клетки. Для окраски спор пользуются специальными методами с применением протрав (кислоты или щелочи). Протравы разрыхляют оболочку споры, облегчая проникновение в нее красителя. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью, в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков: препарат окрашивают основным красителем, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в какой-нибудь контрастный цвет.

а) Окраска спор методом Ожешко:
• На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты (НСl) и подогревают 1-2 мин над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.
• Остывший препарат промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки.
• Окрашивают карболовым фуксином Циля с подогреванием до появления паров.
• Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.
• Промывают водой.
• Докрашивают метиленовым синим Леффлера или 1% водным раствором малахитового зеленого 3-5 мин.

Окрашенные споры имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток приобретают цвет дополнительного красителя — голубой при применении метиленового синего или зеленый при использовании малахитового зеленого.

Споры, обнаруживаемые при помощи светового микроскопа:
a — Bacillus cereus: удлиненные субтерминальные споры (окраска нигрозином);
б — Clostridium pectinovorum: большие терминальные споры внутри спорангиума и отдельные споры без спорангиума (окраска йодом на гранулезу).

б) Окраска спор методом Пешкова:
• На фиксированный мазок наливают метиленовый синий Леффлера, дают краске закипеть. Окрашивание мазка кипящим красителем производится в течение 20-30 с.
• Препарат промывают водой.
• Докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного в течение 30-60 с.
• Промывают водой и высушивают.

Споры, окрашенные метиленовым синим Леффлера, имеют голубой цвет, вегетативные тела бактерий — красный.

в) Окраска спор методом Дорнера:
• Исследуемый мазок высушивают на воздухе.
• Фиксируют над пламенем горелки.
• Покрывают кусочком фильтровальной бумаги, пропитанной карболовым фуксином Циля, поддерживая влажное состояние фильтровальной бумаги добавлением красителя. Мазок подогревают над пламенем горелки 10 мин или помещают стекла на штатив, расположенный над емкостью с кипящей водой.
• Удаляют фильтровальную бумагу и наносят на мазок смесь Никифорова на 1 мин.
• Мазок промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой.
• На предметное стекло с мазком наносят насыщенный раствор нигрозина (рецепт 31).

После окраски вегетативные тела остаются бесцветными, а споры приобретают красный цвет. Микробные тела находятся на черном фоне.

— Читать далее «Способы выявления и окраски капсул микробов»

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 16.05.2019

Оглавление темы «Приготовление мазков и их окрашивание.»:

  1. Методы окраски спор бактерий
  2. Способы выявления и окраски капсул микробов
  3. Окраска зерен волютина бактерий
  4. Окраска клеточной стенки, жгутиков микроорганизмов

Методы окраски микроорганизмов

Окраска микроорганизмов — комплекс методов и приемов, применяемый для изучения морфологических свойств микроорганизмов. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы под микроскопом. Благодаря О. м. можно изучать их морфол. особенности, что необходимо при проведении бактериологического исследования. Окрашивание бактерий производится как для обнаружения их в исследуемом материале при бактериоскопической диагностике, так и для их идентификации после выделения чистой культуры из исследуемого материала при бактериол. исследовании.
Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска. Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1-2 см2. Затем препарат высушивают либо при комнатной температуре на воздухе, либо в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске. Применяют различные способы фиксации. Наиболее простым и самым распространенным способом является фиксация жаром — нагреванием на пламени горелки (препарат несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки). В нек-рых случаях прибегают к фиксации препарата этиловым или метиловым спиртом, ацетоном, смесью равных объемов этилового спирта и эфира (по Никифорову). После фиксации производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски микробов являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.
Существуют простые и сложные способы окрашивания микробов. При простой окраске, к-рая позволяет быстро изучить морфол. особенности микробов, обычно используют только один краситель, чаще всего красного цвета — фуксин (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего цвета — метиленовый синий (время обработки мазка краской 3-5 мин). При сложных методах окраски применяют два или более контрастных красителя, протравы, дифференцирующие вещества и др. Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.
Метод окраски по Граму — наиболее распространенный сложный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин — до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель — йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные — красный.
Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют карболовый фуксин Циля, серную к-ту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином Циля и не обесцвечиваются к-той, некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке к-той и докрашиваются метиленовым синим.
При изучении структуры микробной клетки используют целый ряд сложных методов. Так, для выявления капсулы у бактерий применяют метод Гинса, для обнаружения спор бактерий — метод Ауески, зерна волютина можно окрасить с помощью метода Нейссера. Для выявления жгутиков используют методы «сверхокраски», при к-рых клетки и отдельные их структуры увеличиваются в размерах и становятся видимыми под световым микроскопом. К методам «сверхокраски» относится, в частности, метод серебрения по Морозову. Он также может быть использован для окрашивания спирохет и даже наиболее крупных вирусов — вирусов оспы.
Универсальным методом О. м. является окраска по Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет, форменных элементов крови.

Методы выявления спор у бактерий

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 10

Окраска спор по методу Ожешки: 1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут. 2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки. 3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Также споры не окрашиваются при простых методах окрашивания, и при микроскопии выглядят блестящими…

18. Что такое нумерическая таксономия?

Нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков. Размеры, форма, взаиморасположение.

19. Что такое конститутивные, индуцибельные, репрессибельные ферменты?

Расскажу вам сказочку… жили три брата.
Первый брат — работает всегда, есть кризис, нет, всегда ему будет работа. Например парикмахер, или там гробовщик, ну ладно, водитель такси.

Второй брат — сезонные работы — его канёк, когда есть работа, он везде, его много, но как-то только сезон проходит, он больше никому не нужен до следующего момента.

Третий брат, работает-работает, но перехватили его работу, то, что должен продуцировать — уже очень много, и поэтому он сидит тихо, пока не потребуется.

Конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;

Индуцибельные (адаптивные) – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

Выявление жгутиков

Жгутики бактерий очень тонки и легко отрываются. Поэтому обнаружить их можно только при специальной окраске или с помощью электронного микроскопа.

Выявить жгутики у бактерий, применив обычные способы окраски анилиновыми красителями невозможно.

Жгутики, как правило, становятся видимы, если препарат предварительно обработать протравой, а потом окрасить. Протравленный препарат легче воспринимает окраску, но самое главное то, что жгутики при осаждении на них протравы увеличиваются и становятся видимыми при микроскопировании.

Существуют разные способы окраски жгутиков, но в каждом отдельном случае в зависимости от индивидуальных свойств микробов приходится выбирать тот или иной способ.

Для успешной окраски жгутиков должны соблюдаться следующие условия:
1. Чистота предметных и покровных стекол должна быть идеальной.
2. Препарат должен готовиться из свежей агаровой суспензии культуры не старше суточной, а для некоторых видов (вибрион, сенная палочка) не старше 12 часов. Часть материала, взятую из посевной черты (ближе к конденсационной воде), где больше влаги переносят в пробирку с 1 – 2 мл стерильной водопроводной воды. Пробирки выдерживают 30 60 минут при комнатной температуре, затем взвесь бактерий переносится в каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора, нанесенную на покровное стекло. При распределении материала на покровном стеклышке, надо соблюдать осторожность, чтобы механически не повредить жгутики инее оторвать их от тела бактерий.

Мазок должен быть тонким, чтобы особи могли расположиться изолировано друг от друга.

Воду на стекле следует распределять тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата и уменьшить потерю жгутиков.

Наиболее часто для окрашивания жгутиков используют способ Леффлера (Loffler). Методика окраски:
1. На высушенный и зафиксированный мазок наливают протраву в таком количестве, чтобы покрыть всю поверхность покровного стеклышка, и выдерживают 3 – 5 минут при комнатной температуре.
2. По истечении указанного времени препарат осторожно и тщательно промывают проточной водой.
3. На препарат наносят раствор фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды) и препарат прогревают над пламенем до появления пара.
4. Препарат промывают водой и микроскопируют.

Приготовление протравы для выявления жгутиков бактерий:
12г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды и к этому раствору прибавляют 30 мл насыщенного раствора фуксина в 95% этиловом спирте. Раствор отфильтровывают и хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Протрава готова к употреблению через несколько дней после приготовления и может сохраняться в течение нескольких месяцев.

Для обнаружения жгутиков у простейших препараты можно окрашивать простым способом, используя метиловый синий, раствор Люголя или сложным методом по Романовскому – Гимза.

Выявление капсул у бактерий

Капсулы не обладают выраженным сродством к основным красителям, поэтому для обнаружения капсул применяют различные способы приготовления микропрепаратов и их окраски, учитывая особенности образования и сохранения капсул у разных видов бактерий.

Для обнаружения капсулы необходимо наличие окрашенного внутри капсулы фона и окрашенного наружного фона.

Внутренний фон представлен окрашенной микробной клеткой, находящейся внутри капсулы. А наружный фон, окружающий капсулу, может быть естественным или искусственным.

Если микроб сохраняет капсулу постоянно, т.е. не только внутри макроорганизма, но и на питательной среде (клебсиеллы), то препарат для обнаружения капсул можно приготовить из культуры, выращенной in vitro на питательной среде. И в таком случае наружный фон создается искусственно.

Если микроб образует и сохраняет капсулу только внутри макроорганизма (возбудители сибирской язвы, чумы, пневмококки), то в таком случае делается мазок – отпечаток из пораженного органа погибшего макроорганизма (из печени, селезенки, лимфатических узлов) или из мокроты, содержимого бубона, крови. Наружный фон капсулы будет представлен тканевыми клетками.

Микропрепарат из культуры клебсиелл для обнаружения у них капсулы можно окрасить по методу Бурри – Гинса:
1. На чистое предметное стекло наносится небольшая капля черной туши и капля взвеси суточной агаровой культуры капсульных бактерий. Смесь осторожно перемешивается петлей , после чего другим предметным стеклом делается мазок, подобно мазку крови.
2. После подсушивания на воздухе и фиксации в пламени горелки препарат докрашивают в течение 2 – 3 минут карболовым фуксином Циля, разбавленным дистиллированной водой 1:1.
3. По окончании препарат осторожно промывается струей холодной воды, высушивается и микроскопируется. На темном тушевом фоне будут видны окрашенные микробные клетки окруженные бесцветной капсулой. При отсутствии капсулы, к клетке окрашенной фуксином, черный фон примыкает вплотную.

В том случае, если микропрепарат готовится из исследуемого материала, мазок может быть окрашен одним анилиновым красителем, по методу Грамма, по методу Романовскго – Гимза. В каждом из этих трех споосбов окраски на фоне окрашенных тканевых клеток, будет видна бесцветная капсула, окружающая окрашенную микробную клетку. Обнаружение спор.

Благодаря толщине свое оболочки и плотности содержимого, споры остаются неокрашенными при обработке препарата анилиновыми красителями простым методом или сложным по Граму.

При окраске по Граму или по Леффлеру спора внутри окрашенной цитоплазмы микробной клетки выглядит как зернышко круглой или овальной формы, сильно преломляющее свет.

Существует несколько методов окраски спор (по Циль – Нильсену, по Ганзену, по Ожешко и др.) позволяющих достигнуть контрастной окраски спор в цитоплазме.

Методика окраски микропрепарата:
1) На фиксированный препарат накладывается полоска фильтровальной бумаги (для защиты препарата от оседающих кристаллов красителя) и на нее наливается карболовый фуксин Циля. Препарат осторожно прогревается в течение 3 – 4 минут над пламенем горелки. По мере испарения жидкости краситель добавляется.
2) Фильтровальная бумага снимается и на мазок наносится 2 – 3 капли 5% раствора кислоты (серной, соляной, азотной или уксусной) на 30 секунд.
3) Препарат тщательно промывается струей холодной воды и высушивается.
4) Докрашивается раствором метиленовой сини Леффлера в течение 1 – 2 минут.
5) Препарат промывается струей воды, высушивается и микроскопируется. На голубом фоне цитоплазмы видны сиренево – красные споры.

Этот метод позволяет обнаружить споры не только в процессе их формирования внутри клетки, но и после того как сформированная спора высыпалась из разрушившейся микробной клетки.

Приготовление карболового фуксина Циля:
10 мл. насыщенного спиртового раствора фуксина растворяют в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.

Обнаружение зерен волютина

Зерна волютина (запасные вещества полифосфатной природы) можно обнаружить в клетках многих микроорганизмов.

У бактерий и актиномицетов гранулы волютина располагаются в цитоплазме, у дрожжей и грибов – в вакуолях. Как правило, зерен волютина больше в молодых клетках.

В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью.. Однако лучше наличие зерен волютина определяется в окрашенных препаратах. Для обнаружения зерен волютина применяется окраска метиловой синью по Леффлеру. Зерна волютина при этом окрашиваются в сине – фиолетовый цвет, а протоплазма – в голубой.

Дифференциальная окраска зерен волютина может быть достигнута различными способами окраски, в том числе и способом Нейссера (Neisser). Нейссер разработал и предложил для выявления зерен волютина в клетках дифтерийных бактерий.

При окраске по способу Нейссера зерна волютина окрашиваются в синий или темно – коричневый цвет, а протоплазма – в светло – коричневый.

Зерна волютина можно выявить окраской по способу Омелянского. Для этого на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 30 секунд. После чего краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 30 – 40 секунд 1% раствором серной кислоты. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и докрашивают метиловым синим в разведении 1:40 в течение 30 секунд. После промывки водой препарат высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина при этом способе окраски окрашиваются в сиренево – красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

При окраске препарата по методу Грама зерна волютина по тональности и интенсивности окраски не дифференцируются от цитоплазмы, поэтому окраску по методу Грама для выявления зерен волютина применять не имеет смысла.

У некоторых микроорганизмов запасные вещества накапливаются в виде гранул углеводной природы. Их можно выявить при обработке клеток раствором Люголя. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов – в красновато – коричневый цвет.

Окрашивание микропрепаратов из исследуемого материала

Микропрепараты из крови окрашивают по Романовскому – Гимза, фуксином, метиловым синим или другими анилиновыми красителями.

Для наблюдения вегетативных стадий кишечных простейших пользуются прижизненной окраской паразитов раствором Люголя, слабыми растворами основных красителей (эозин, метиловый синий и др.) в разведении 1:1000 и даже 1: 10000. Для более подробного изучения паразитов, препараты фиксируют жидкими фиксаторами (жидкость Шаудина, метиловый или этиловый спирт) и окрашивают гематоксилином, метиловым синим, фуксином, краской Романовского.

При микроскопическом исследовании мазков мочи, спинномозговой жидкости, мокроты фиксированные препараты окрашивают по Граму, по Романовскому — Гимза, метиловым синим

Фиксированные микропрепараты из гнойного содержимого язв, пунктатов бубонов, лимфатических узлов в зависимости от предполагаемого возбудителя окрашивают по Граму, по Бури, по Романовскому – Гимза, серебрением по Морозову.

КАПСУЛА БАКТЕРИЙ, ЕЕ РОЛЬ ,МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ .

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 10

Капсула – структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхности клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных мицелл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), полипептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микроскопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который непрочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микроба.

У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes). У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringens капсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором вирулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых металлов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью.

СПОРЫ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ, СТАДИИ ОБРАЗОВАНИЯ ,УСЛОВИЯ ДЛЯ СПОРООБРАЗОВАНИЯ ,СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ.

Споры – покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри цитоплазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспечивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микробы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэробные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в связанное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры.

Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из которых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов – проспора (предспора) – покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клетки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикальный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой оболочкой – экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого наступает аутолиз вегетативной клетки.

При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация метаболических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса.

Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.

Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор.

Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою биомассу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.

Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специальный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препарат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зерна.

ЖГУТИКИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ .ИНЖЕКТИСОМА ,СТРОЕНИЕ ,ФУНКЦИИ .

Жгутики – органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3-5х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфичностью (см. Н-антиген).

Для изучения жгутиков существуют прямые и косвенные методы. Прямые – это электронная микроскопия и световая после окраски по Лёффлеру. Косвенные – посев уколом в столбик полужидкого агара и микроскопия нативного материала в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли в световом и фазово-контрастном микроскопах.

По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи – имеют 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихи – без жгутиков.

Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) – это органы прикрепления. Наиболее изучены 2 вида пилей – половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина.

НУКЛЕОИД, ФУНКЦИЯ ,МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОИДА .

Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядерной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата.

В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделению дочерних хромосом при репликации. Бактерии – гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправленном состоянии ее длина 1 мм.

Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках – несколько, в старых – 1, у кокков – 1, у палочковидных – много.

Функции нуклеоида: хранитель генетической информации, которая закодирована в ДНК; принимает участие в генетических процессах (мутациях, рекомбинациях), а также в делении бактерий и спорообразовании.

Доказательства наличия нуклеоида:

– цитохимическая реакция Фельгена на ДНК. На мазок бактерий наносят соляную кислоту, при этом из дезоксирибозы образуются альдегиды, которые с фуксинсернистой кислотой реактива Шиффа дают фиолетовое окрашивание;

– люминесцентная микроскопия: при окраске мазка акридиновым оранжевым ДНК в ультрафиолете светится зеленым светом, РНК – красным;

– электронная микроскопия ультратонких срезов.

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

I. Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную карболово-спиртовым раствором генцианового фиолетового и сверху капают несколько капель дистиллированной воды на 1-2 мин.

2. Убирают фильтровальную бумагу и, не промывая водой, наносят раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают спиртом – 30 секунд.

4. Тщательно промывают водой.

5. Докрашивают водным раствором фуксина 1-2 мин., промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: Гр(+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, Гр(-) бактерии – в розовый.

II. Окраска по Бурри-Гинсу:

1. Каплю взвеси микробов смешивают с каплей туши на обезжиренном стекле и готовят мазок шлифованным краем стекла, как мазки крови, высушивают, фиксируют.

2. Наносят водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: на темном фоне туши видны неокрашенные светлые капсула, внутри которой – красные бактерии.

III. Окраска по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 мин.

2. Кислоту сливают, промывают мазок, просушивают, фиксируют в пламени горелки.

3. Через фильтровальную бумагу наносят карболовый фуксин Циля, подогревают над пламенем горелки до трехкратного появления паров.

4. Снимают бумагу, промывают водой.

5. Обесцвечивают мазок 5% раствором серной кислоты 1-2 мин.

6. Промывают водой.

7. Докрашивают метиленовым синим 3-5 мин.

8. Промывают,высушивают, микроскопируют.

Результат: споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *