Определение ферментативной активности микроорганизмов

Ферментативная активность микроорганизмов

Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы.

  • Среды с сахарами или многоатомными спиртами, для определения сахаролитической активности микроорганизмов.

  • Среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и т. д.) для выявления протеолитических ферментов.

  • Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами.

  • Среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред обычно вводят индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.

Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахара» расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества.

Сахаролитические свойства, т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа

Эти свойства изучают на: жидких и полужидких средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

на плотных средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы сбраживают до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу) и образуют окрашенные колонии — кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

на средах с крахмалом (среда Кодама) определяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, — цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

молоко при росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

среда Вильсон-Блера. Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na2S04, хлористое железо FeCl . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Разрыв питательной среды связан с расщеплением глюкозы до газа.

Микротест — системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально- диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Протеолитические свойства — способность расщеплять белки изучают:

на средах с желатином. В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитический фермент выявля­ется путем разжижения желатины.

на средах с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока — оно приобретает вид молочной сыворотки.

на средах с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца — бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

Гемолитические свойства микроорганизмов изучают на питательных средах с добавлением эритроцитов (кровяной МПА — для культивирования аэробов, среда Цейсслера — для культивирования анаэробов). На плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона гемолиза.

к работе №6

Каталазная активность. Каталаза — это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают кашпо перекиси водорода и суспензируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде

Подпись преподавателя________________________________________________________

Методы изучения ферментативной активности бактерий

Ферменты бактерий.

Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками.

Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

— 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

— 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим;

— 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды;

— 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

— 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

— 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты.

Эндоферментыкатализируют процессы внутри клетки. Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Это ферменты: а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий;

— гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту;

— дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;

— фибринолизин – расщепляет коллаген;

— плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;

— нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;

— лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки — протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков — образование щелочей, H2S, NH3.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки — E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо — красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды — розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается «пестрый ряд». Каждый вид бактерий характеризуется своим «пестрым рядом».

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент — коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола — щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. Вещества ферментной природы обладают рядом общих особенностей:

1) небольшое количество катализатора обеспечивает превращение большого количества субстрата (одна часть химозина может свернуть 12 млн. частей молока), оставаясь при этом в свободном состоянии;

2) для ферментов характерна высокая специфичность действия (лактаза гидролизует только лактозу, не действуя на родственные сахара);

3) ферменты, синтезируемые микробной клеткой, способны действовать, будучи выделенными из нее .

Согласно международной биохимической классификации ферментов, в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, традиционное (тривиальное) название, а также четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия ферменты микроорганизмов имеют традиционные названия, получаемые в зависимости от субстратной специфичности. Традиционно ферменты микроорганизмов классифицируются на сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферменты-токсины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов.

В микробной клетке может находиться большое количество ферментов, благодаря чему микроорганизмы способны осуществлять одновременно ряд различных реакций.

Наиболее высокой ферментативной активностью обладают сапрофиты; в меньшей степени это свойство выражено у патогенных бактерий. Изучение ферментов патогенных бактерий имеет исключительно важное значение, так как на основании определения ферментативной активности микробов можно дифференцировать различные виды и определять природу того или иного возбудителя заболеваний. Наряду с этим ферментативная активность микробов определяет патогенез и клиническую картину инфекционного заболевания.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.

Ферменты бактерий подразделяются на экзо- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов .

Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. Конститутивные ферменты синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются только при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, кишечная палочка на среде с глюкозой практически не образует Р-галактозидазу, но резко увеличивает ее синтез при выращивании на среде с лактозой или другим Р-галактозидом .

Некоторые ферменты (так называемые ферменты агрессии) разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое распространение в инфицированной ткани микроорганизмов и их токсинов. К таким ферментам относят гиалуронидазу, коллагеназу, дезоксирибонуклеазу, нейраминидазу, лецитовителлазу и др. Так, гиалуронидаза стрептококков, расщепляя гиалуроновую кислоту соединительной ткани, способствует распространению стрептококков и их токсинов .

Ферментативную активность бактерий и грибов широко используют в промышленности для получения органических кислот (уксусной, молочной, щавелевой, лимонной), приготовления молочных продуктов (сыр, ацидофилин, кумыс), в виноделии, пивоварении и других отраслях промышленности. Посредством микробного синтеза получают амилазы для гидролиза крахмала, протеиназы для обработки кож, пектиназы для осветления фруктовых соков.

Список использованных источников:

1 Ленинджер, А. Основы биохимии: В 3-х томах. Том 1 / А. Ленинджер. – Москва: Мир, 1985. – 367 с.

Ферменты агрессии

Факторы вирулентности

Свойства возбудителей инфекций

Основным свойством возбудителей инфекций является патогенность — это способность микробов размножаться в организме человека, вызывая при этом развитие патологических изменений (болезнь). Патогенность это генетически обусловленный видовой признак, характеризующийся специфичностью.

Специфичность патогенных микроорганизмов проявляется в способность данного вида возбудителя вызывать определенные заболевания.

Для обозначения степени патогенности и ее количественного выражения введено понятие вирулентности.

Вирулентность — это степень патогенности возбудителя. Она может усиливаться или уменьшаться в зависимости от внешних условий. Чем выше вирулентность, тем тяжелее протекает инфекционный процесс (ИП).

1. Адгезия — способность возбудителя прилипать к тканям макроорганизма. Обеспечивается наличием у патогенных микроорганизмов пилей.

2. Инвазивность — способность возбудителя проникать внутрь организма через кожу и слизистые за счет наличия ферментов агресии.

3. Колонизация — способность возбудителя размножаться в тканях и органах человека.

4. Подавление фагоцитоза за счет образования бактериями капсул.

5. Токсигенность — способность бактерий выделять яды (токсины).

Ониобеспечивают проникновение микроорганизмов в организм и их поражающее действие.

Входные ворота — это те органы и ткани организма человека через которые в него проникает патогенный микроорганизм.

К ферментам агрессии относятся:

1. Гиалуронидаза — расщепляет гиалуроновую кислоту соединительных тканей

2. Фибринолизин — растворяет сгустки фибрина, это фермент инвазивности, обеспечивающий проникновение микроорганизма в организм.

3. Лецитиназа — расщепляет лецитин, содержащийся в клеточной оболочке

4. Коагулаза — свертывает плазму крови.

5. Нуклеаза — разрушает ДНК, РНК.

Патогенетические факторы микробов. Виды и характеристика бактериальных ферментов агрессии

Для осуществления колонизаиии и инвазии многие бактерии выде­ляют ферменты агрессии и защиты:

• нуклеазы;

• протеазы, действие которых в первую очередь направлено на разрушение антител;

• лецитовителлаза — лецитиназа, разрушает клеточные мембраны;

• плазмокоагулаза — способствует образованию фибриновых барь­еров;

• антифагин — липополисахарид, оказывающий токсическое действие на фагоциты;

• фибринолизин — протеолитический фермент, который растворя­ет сгустки фибрина;

• гиалуронидаза — фермент, гидролизующий гиалуроновую ки­слоту — основной компонент соединительной ткани;

• нейраминидаза — отщепляет от различных гликопротеидов, гликолипидов, полисахаридов сиаловую (нейраминовую) ки­слоту, повышая проницаемость различных тканей.

Три последних фермента облегчают распространение микроор­ганизмов в тканях организма.

57. Патогенетические факторы микробов. Способы «экранирования» патогенных микробов в организме. Факторы персистенции микроорганизмов.

Второй тип характеризуется длительным пребыванием микроба в макроорганизме, или персистенцией (от лат. persistentia — сохранение предыдущего состояния, упорство, постоянс­тво). Персистенция говорит о неспособнос­ти общества и макроорганизма справиться с микробом и о способности последнего выжить в макроорганизме. Механизмы развития персистенции разнообразны. Важную роль иг­рают:

образование морфологически изменен­ных или дефектных форм микробов (L-форм бактерий, цист, дефектных вирусных частиц);

формирование лекарственной устойчивости, способность микробов к внутриклеточному паразитированию (возбудители малярии и лейшмании, вирусы, хламидии и т. д.);

блоки­рование апоптоза клеток хозяина;

наличие как врожденных, так и приобретенных иммунодефицитов, в том числе под действием микробов;

развитие иммунологической толерантности, а также аутоиммунных и аллергических реак­ций в макроорганизме и т.д.

Отличительном чертой персистенции является то, что она раз­вивается на фоне приобретенного иммуните­та, который оказывается неэффективным, а также то, что для ряда микробов она является патогенетической нормой (вирусы, риккетсии и хламидии, микобактерии, трепонемы, бруцеллы, возбудитель четырехдневной малярии).

Персистенция может проявляться в форме:

микробоносительства (бактерио-, паразите-, вирусо- или миконосительства), представля­ющего собой инфекционный процесс насуб­клиническом уровне, при котором микроб короткий или длительный промежутоквреме­ни, а в ряде случаев пожизненносохраняется

в макроорганизме, не вызывая клинических проявлений, и выделяется в окружающую среду. Микробоносительство сопровождает­ся иммунологическими изменениями в мак­роорганизме. Морфологические и функцио­нальные изменения в макроорганизме слабо выражены. Исключение составляет здоровое микробоносительство, при котором морфофункциональных и иммунологических изме­нений нет. Носительство может формировать­ся как в результате перенесенного заболевания (брюшной тиф, сальмонеллез, дифтерия), так и являться одной из стадий инфекционно­го процесса, предшествуя его генерализации (менингококковая инфекция);

латентной инфекции (син. дремлющая ин­фекция), являющейся своеобразной формой микробоносительства, при которой микроб длительно находится в макроорганизме, но не выделяется в окружающую среду. Как прави­ло, латентная инфекция является закономер­ной стадией инфекционного процесса при заболеваниях, склонных к хроническому те­чению (бруцеллез, сифилис, герпетическая инфекция, токсоплазмоз);

хронической инфекции, которая длится свы­ше 6 месяцев и может протекать в виде непре­рывной или рецидивирующей формы, харак­теризующейся сменой периодов ремиссий и обострений, при которых микробы выделя­ются в окружающую среду в течение многих месяцев и даже лет. К первично-хроническим заболеваниям относятся бруцеллез, туберку­лез, лепра, малярия и сифилис.

В вирусологии в отдельную группу выделе­ны медленные вирусные инфекции.

Аг — вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций (гуморальных, клеточных, состояние иммунной толерантности, индуцирование иммунной памяти). Свойства Аг определяются комплексом призна­ков: иммуногенность, антигенность, специфичность, чужеродность.

Иммуногенность — способность индуцировать иммунный ответ.

Антигенность — способность Аг избирательно реагировать со специфичными к нему AT или Аг-распознающими рецепторами лимфоцитов.

С понятием «антигенность» связан другой термин «чужеродность»: без чужеродности нет антигенности применительно к конкретному организму. Например, альбумины мыши не проявляют антигенные свойства по отношению к другим мышам, но являются Аг для морской свинки.

Специфичность — структурные особенности, отличающие один Аг от другого.

Способностью вызывать развитие иммунного ответа и определять его специфичность облада- ttфрагмент молекулы Аг — антигенная детерминанта (эпитоп), избирательно реагирующая с Аг распознающими рецепторами и AT. Антигенные детерминанты располагаются в областях Аг, обращенных к его микроокружению. Эпитоп — наименьшая распознаваемая единица Аг, молекула Аг может иметь несколько эпитопов, то есть быть поливалентной. Чем сложнее молекула Аг и чем больше у неё эпитопов, тем больше вероятность развития иммунного ответа. Структура многих антигенных детерминант известна. Например, в полипептидной последовательности эпитопом может быть фрагмент из 7-8 аминокислотных остатков; свойства антигенности и специфичности определяются также пространственной конфигурацией фрагмента.

Моноклональные AT специфически распознают только одну Аг-детерминанту и связываются с ней. Поликлональные AT, как правило, распознают несколько антигенных детерминант в составе Аг.

Валентность Аг. Белки содержат несколько Аг-детерминант. Количество молекул AT, связы­вающих все эпитопы, определяет валентность Аг (возрастает пропорционально увеличению молекулярной массы белковой молекулы).

Какие ферменты «защиты и агрессии» бактерий вы знаете? Методы их обнаружения у бактерий.

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 3

Ферменты «защиты и агрессии» способствуют распространению бактерии в тканях организма. К ним относят плазмокоагулазу, фибринолитический фермент, лецитиназу, гиалуронидазу, ДНК-азу и др.

Для выявления гиалуронидазы кролику в один участок депилированной кожи вводят внутрикожно 0,2 мл туши в физрастворе, а в соседний участок – 0,2 мл туши с прибавлением фильтрата бульонной культуры стафилококка. Пятно на месте инъекции туши с фильтратом через 24-48 ч в несколько раз превосходит по размерам пятно на месте введения туши без фильтрата за счет повышения проницаемости ткани в присутствии гиалуронидазы.

Для выявления фибринолитического фермента в чашки Петри с агаровой средой, содержащей плазму, засевают испытуемую культуру. После инкубации в течение 24-48 ч при 37 градусах образуется зона просветления вокруг колоний бактерий , продуцирующих фибринолизин.

Для выявления плазмокоагулазы испытуемую культуру засевают в 0,2 мл цитратной кроличьей или человеческой плазмы. В случае выработки плазмокоагулазы через 2-4-6-18 ч после инкубации при 37 градусах происходит свертывание плазмы. В контроле плазма остается жидкой.

Для выявления лецитиназы изучаемую культуру засевают на желточный агар . при наличии лецитиназы вокруг колоний бактерий образуется зона помутнения и радужного венчика.

Экзотоксины бактерий, их отличительные свойства.

Отличительные свойства экзотоксинов:

· имеются и у Г-, и у Г+ бактерий,

· представляют собой белки, секретирующиеся во внешнюю среду,

· среди них есть и термостабильные, и термолабильные,

· высокая сила действия,

· избирательность и специфичность действия,

· индукция образования антитоксинов,

· превращение в анатоксины при обработке формалином (инактивация).

Анатоксины, их получение, практическое использование.

Анатоксины – это токсины, лишенные токсических свойств, но сохранившие способность индуцировать синтез антитоксинов. Широко используются для создания искусственного иммунитета против дифтерии, столбняка, ботулизма и др. Анатоксины получают при обработке экзотоксинов формалином.


Методы определения токсигенности бактерий.

Патогенность МО, определение понятия. Вирулентность, единицы измерения.

Патогенность – это способность МО в чувствительном к нему макроорганизме вызывать развитие той или иной формы инфекции (не обязательно заболевание!). Это качественное понятие, понятие о бактериию

Вирулентность – это степень, или мера, патогенности. Единицы измерения: Dlm – вызывает гибель 80% животных,Dcl – безусловно летальный исход, Dl50 – среднестатистическая летальность, для 50% животных. Это количественное понятие, понятие штаммовое.

Эти понятия могут использоваться как синонимы, но это не совсем корректно.

Анатомо-физиологические механизмы врожденного иммунитета.

К ним относятся:

1). Кожа и слизистые оболочки – защитные механизмы:

механические (слущивание кожи, наличие мерцательного эпителия),

химические (продукция кожного сала кожей, лизоцим в слене, слезной жидкости, мокроте),

биологические (за счет нормальной микрофлоры).

2). Нормальная микрофлора в толстом кишечнике.

3). Барьерная роль лимфоузлов (выполняют роль сита) – если они увеличены в размерах, значит имеет место воспалительный процесс или опухоль.

4). Фагоцитоз.

5). Воспаление – 4 признака + 1 в Средневековье:

· ruber — покраснение

· tumer – припухлость,

· calor – местное повышение температуры,

· dolor – боль

· + нарушение функции.

6). Лихорадка:

· чаще температура увеличивается ,

· тотальный метаболический ацидоз.

7). Функции выделительной системы:

· отшелушивание роговых чешуек, мерцание ресничек,

· рвота, диарея,

· выведение возбудителя с мочой через почки.

8). Гуморальные факторы – бактерицидные свойства жидких сред организма:

· слюна – лизоцим,

· желудочный сок – соляная кислота,

· жёлчь

· кровь – система комплемента.

9). Механизмы самозащиты на уровне генома клетки:

· ревизия,

· супрессия,

· репарация,

· модификация и рестрикция,

· подавление репродукции в клетках чужеродного генома,

· подавление выражения информации чужеродного генома, интегрированного в геном клетки-хозяина.

Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника человека. Почему она является мощным фактором врожденного иммунитета?

Нормальная микрофлора толстого кишечника:

· остаточная МФ – 0,001-0,01% (стафилококки, протеи, кандида, транзиторная МФ).

Нормальная МФ является мощным фактором врожденного иммунитета, т.к. выполняет ряд важнейших функций:

· колонизационная резистентность (просветные, пристеночные),

· угнетает рост патогенной и гнилостной МФ,

· стимулирует лимфоидную ткань,

· участвует в пищеварении (клетчатка),

· снабжает организм витаминами (группы В, К) и АК-тами (кишечная палочка синтезирует триптофан).

Комплемент, состав и основные функции.

Комплемент – большая группа взаимодействующих между собой сывороточных белков и гликопротеинов , имеющихся у всех позвоночных (белки С1 – различные факторы и инактиваторы, всего около 20 компонентов). Синтезируется иммунокомпетентными клетками.

Основные функции:

1) лизис чужеродных клеток,

2) опсонизация – т.е. чужеродные клетки становятся более доступными для макрофагов,

3) стимуляция хемотаксиса,

4) стимуляция фагоцитоза,

5) повышение сосудистой проницаемости, усиление лейкоцитоза,

6) стимуляция анафилотоксинами процессов, в результате которых выбрасываются БАВ.

Пути активации системы комплемента.

Три пути активации комплемента:

1) классический, инициируемый комплексом антиген-антитело,

2) альтернативный, инициируемый эндотоксинами,

3) механизм С-шунта; при дефиците С4-компонента, требует активации С1-компонента.

Понятие о системе мононуклеарных фагоцитов, функции макрофагов.

Фагоцитарные клетки:

· микрофаги (гранулоциты),

· макрофаги (моноциты и клетки ретикулоэндотелиальной системы)

Макрофаги – клетки, обладающие высокой фагоцитарной активностью. Они различаются по форме и размерам, в зависимости от того, в какой ткани обнаруживаются. По классификации ВОЗ все макрофаги объединены в систему мононуклеарных фагоцитов. К этой системе относятся клетки, имеющие костномозговое происхождение, обладают активной подвижностью, способны осуществлять фагоцитоз и прилипают к стеклу.

Функции макрофагов:

· хемотаксис,

· фагоцитоз,

· выработка биологически активных соединений,

· переработка антигена (процессинг) и его презентация.

Методы определения ферментативной активности микробов

⇐ ПредыдущаяСтр 16 из 28

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микро­организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов). Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве­ществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют. Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис­лительно-восстановительные реакции. К ним отно­сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2). Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью. К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных еди­ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре­вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт­ных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты. Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств. К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре­де. Например, фермент бета-галактозидазаначинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса. В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2). При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Date: 2016-07-18; view: 340; Нарушение авторских прав

Понравилась страница? Лайкни для друзей:

Определение ферментативной активности.

Выявление каталазы проводят на предметном стекле в капле 5 % перекиси водорода. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода.

Выявление оксидазы также проводят на предметном стекле. Вносят в каплю 1 % р-ра дигидрохлорида тетраметил-n-фенилендиамина. При положит. реакции в течен. мин развивается розово-красная окр-ка.

Выявление дегидрогеназ: в пробирку вносят 1 мл суспензии бактерий, добавляют 0,5 мл 3 % раствора 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ). Смесь помещают в термостат на 30 мин. Если дегидрогеназы восстанавливают ТТХ до формазана, то развив-ся красное окра-ие трифенилформазана.

Тест на знание английского языка Проверь свой уровень за 10 минут, и получи бесплатные рекомендации по 4 пунктам:

  • Аудирование
  • Грамматика
  • Речь
  • Письмо

Проверить

Утилизация микроорганизмами источников углерода Культуры высевают на среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды: глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, глицерин, маннит. Среды Гисса: • Основной фон (в %, пептон – 0,5; К2НРО4 – 0,1); • Индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, феноловый красный);• Исследуемый углевод или спирт (1 %).

Рост микроорганизмов может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот регистрируется по изменению рН среды, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора. Образование газа определяют по появлению пены, разрывов и пузырьков.

Определение способности использовать углеводы на агаризованных синтетич. средах. На пов-сть агаризованной среды с углеводом или спиртом с помощью петли засевают штрихом испытуемые микроорганизмы. Чашки инкубируют при оптимальной для роста температуре. Результаты учитывают по наличию роста культур в сравнении с ростом на контрольной чашке, не содержащей испытуемых соединений.

Определение продукции гидролитических ферментов Микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов различные высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, липиды. Макромолекулы не могут проникать через цитоплазматическую мембрану. Первоначально под действием гидролитических ферментов, которые выделяются микроорганизмами, они переходят в низкомолекулярные продукты, которые с помощью специализированных транспортных систем поступают в бактериальные клетки. Микроорганизмы выращивают в питательной среде, которая содержит макромолекулярное соединение. Если клетки образуют экзоферменты, то вокруг колоний, образуется зона продуктов гидролиза.

Определение протеолитической активности заключается в выявлении протеаз, которые катализируют расщепление белков на поли и олигопептиды. Активность последних определяют, используя в качестве субстратов, желатину, казеин и другие белки.

Разжижение желатины. Разжижение желатины регистрируют визуально, при этом отмечают интенсивность и характер разжижения, которое может быть послойным, мешковидным, пузыристым.

Узнай стоимость написания работы Получите ответ в течении 5 минут. Скидка на первый заказ 100 рублей!

О наличии протеолитических ферментов может свидетельствовать и гидролиз казеина. В этом случае обезжиренное (0,3 – 0,5 %) молоко смешивают с питат. средой и определяют образование сгустков. Определение амилолитической активности заключается в посеве на поверхность полноценной питательной среды, которая содержит 0,2 % растворимого крахмала. Через 3 – 5 суток инкубирования на поверхность среды в чашках Петри наносят раствор Люголя. При отрицат. реакции поверхность остается синей. Если бактерии гидролизуют крахмал, то питательная среда не окрашивается.

Утилизация органических азотсодержащих веществ

В результате этого разложение белков сопровождается выделением побочных продуктов:

аммиака (при дезаминировании аминокислот); сероводорода при использовании серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин, метионин), индола при утилизации триптофана. Обнаружение подобных

продуктов свидетельствует об использовании вышеперечисленных соединений.

Определение образования индола 1 – 2 мл реактива Эрлиха (парадиметиламинобензальдегид, раство-

ренный в этаноле и соляной кислоте). При положительной реакции образуется красное кольцо на границе раздела со средой. В качестве индикатора могут выступать и фильтровальные бумажки, пропитанные насыщенным раствором щавелевой кислоты, которые помещают под пробку и которые изменяют цвет (от розового до красного) при образовании индола.

Определение образования сероводорода также проводят с использованием индикаторных бумажек, пропитанных раствором уксуснокислого свинца. почернение бумаги = сульфид свинца.

Определение образования аммиака индикаторной бумажки, пропитанной реактивом Крупа. Об образовании аммиака свидетельствует покраснение бумаги.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *