Методы выделения чистых культур аэробов

Содержание

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Современные

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

1. Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

Выделение чистых культур микроорганизмов.

  • •Руководство
  • •Раздел «морфология микроорганизмов» Тема: Виды микроскопии: назначение и принципы применения
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Светопольная микроскопия. Устройство светопольного микроскопа ипорядок работы с ним
  • •Темнопольная микроскопия
  • •Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия
  • •Люминесцентная микроскопия
  • •Электронная микроскопия
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Подготовка предметных и покровных стекол
  • •Исследование микроорганизмов в живом состоянии
  • •Препараты фиксированных окрашенных клеток. Приготовление мазка и фиксация препарата
  • •Окраска препаратов
  • •Виды красителей
  • •Методы окраски
  • •Окраска фиксированных препаратов микроорганизмов
  • •Окраска разведенным карболовым фук­сином
  • •Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии
  • •Сложные или дифференциальные методы окраски микробов Дифференциально-диагностический метод окраски по Граму
  • •Видоизменение окраски Грама по а. И. Синеву
  • •Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов
  • •Окраска по Цилю-Нильсену
  • •Флуорохромирование аурамином
  • •Модификация Шеффлера и Фултона
  • •Окраска по Биттеру
  • •Окраска капсул
  • •Метод Бурри-Гинса
  • •Способ Михина
  • •Метод Леффлера
  • •Серебрение по Морозову
  • •Метод Грея
  • •Окраска по Шенку
  • •Метод Петрука
  • •Окраска включений в бактериях Окраска метахроматических зерен (волютина)
  • •Метод Нейссера
  • •Метод Пью
  • •Окраска по Мейеру
  • •Флуорохромирование волю­тина корифосфином
  • •Окраска по Раскиной
  • •Окраска на грамофильную зернистость Метод Муха
  • •Метод Козлова
  • •Выявление клеточной стенки бактерий
  • •Метод Пикарского
  • •Окраска риккетсий Метод Романовского-Гимза
  • •Метод Здродовского
  • •Окраска хламидий
  • •Метод Хайденхайна
  • •Окраска йодом и йод-эозином
  • •Негативная окраска по Бурри
  • •Дифференциальное окрашивание мицелия
  • •Окрашивание ядерного аппарата Метод Фельгена
  • •Трехцветное окрашивание по Флеммингу
  • •Окрашивание гематоксилином Делафильда
  • •Окрашивание гематоксилином и эозином (или эритрозином)
  • •Микроскопия вирусов
  • •Окраска препаратов Окраска по Романовскому
  • •Окраска по Муромцеву
  • •Окраска по Морозову
  • •Окраска по Селлеру
  • •Окраска по Пигаревскому
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Раздел: “физиология микроорганизмов”
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Требования, предъявляемые к питательным средам
  • •Выделение чистых культур микроорганизмов.
  • •Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
  • •Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах
  • •Пигменты микроорганизмов
  • •Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах
  • •Второй этап выделения чистой культуры
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Сахаролитические ферменты микробов
  • •Протеолитические ферменты микробов
  • •Определение индола в культуре микроорганизмов
  • •Определение сероводорода
  • •Третий этап выделения чистой культуры.
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Методы культивирования анаэробных микроорганизмов
  • •Физические методы
  • •Химический метод
  • •Биологический метод
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Методы санитарно-микробиологического анализа воды.
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Стерилизация. Методы стерилизации.
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Раздел: ”химиотерапия инфекционных заболеваний ”.
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам
  • •Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом “бумажных дисков”
  • •Метод двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде
  • •Метод двукратных серийных разведений в плотной питательной среде
  • •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в жидких средах
  • •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в плотных средах
  • •Определение чувствительности микроорганизмов к нитрофурановым препаратам методом разведений в жидких средах
  • •Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах
  • •Ускоренные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Раздел: «фитопатогенные микроорганизмы. Методы микробиологического контроля лекарственного сырья и готовых лекарственных средств
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Определение микробиологической чистоты лекарственного сырья и готовых лекарственных средств, не обладающих антимикробными свойствами
  • •Подготовка образцов для анализа
  • •Питательные среды
  • •Определение общего числа бактерий
  • •Определение количества плесневых и дрожжевых грибов
  • •Определение присутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae
  • •Определение присутствия s. Aureus и p.Aeruginosa
  • •Определение микробиологической частоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием
  • •Количественное определение бактерий и грибов
  • •Количественное определение бактерий сем. Enterobacteriaceae (e.Coli)
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки.
  • •Литература
  • •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева
  • •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ методом мембранной фильтрации
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Определение стерильности лекарственного средства
  • •Раздел: » инфекция и иммунитет»
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Экспериментальная инфекция
  • •Выбор и подготовка к заражению лабораторных животных
  • •Методы заражения лабораторных животных
  • •Вскрытие зараженных лабораторных животных
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Основы иммунодиагностики
  • •Сбор иммунологического анамнеза и характеристика основных иммунопатологических синдромов
  • •Диагностические тесты, проводимые непосредственно у больного (тесты in vivo)
  • •Основные тесты лабораторной иммунодиагностики
  • •Методы исследования лимфоцитов
  • •Методы, основанные на изучении поверхностных маркеров
  • •Исследование функционального состояния лимфоцитов
  • •Реакция бласттрансформации лимфоцитов (рбтл)
  • •Оценка интенсивности продукции цитокинов
  • •Оценка гиперчувствительности замедленного типа
  • •Оценка функционального состояния фагоцитов
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Реакции антиген-антитело. Химические основы
  • •Определение аффинности антител
  • •Основные методы выявления антител и антигенов
  • •Методы, основанные на реакции преципитации
  • •Двойная радиальная иммунодиффузия
  • •Иммуноэлектрофорез
  • •Электроиммунный анализ
  • •Встречный электрофорез
  • •Методы, основанные на реакции агглютинации
  • •Реакция непрямой агглютинации (гемагглютинации) (рнга)
  • •Реакция торможения непрямой гемагглютинации (ртнга)
  • •Методы, основанные на использовании меченых реагентов
  • •Радиоиммунологические методы
  • •Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблоттинг)
  • •Иммуноферментные методы
  • •Иммунофлуоресцентные методы
  • •Применение двойной флуоресцентной метки
  • •Реакция лизиса
  • •Реакция связывания комплемента
  • •Реакция нейтрализации
  • •Феномен иммуноклеточного прилипания
  • •Задания к лабораторному занятию.
  • •Вопросы для самоподготовки
  • •Литература
  • •Общая характеристика, основы производства и применения бактерийных и вирусных препаратов.
  • •Этапы создания искусственной вакцины
  • •Аспекты gmp
  • •Персонал
  • •Помещения и оборудование
  • •Помещения для животных и уход за ними
  • •Документация
  • •Производство Исходные материалы
  • •Партии посевного материала и система банков клеток
  • •Принципы работы
  • •Контроль качества
  • •Методы и условия введения препаратов
  • •Методика введения гетерогенных (из крови животных) сывороток и иммуноглобулинов с предварительной внутрикожной пробой.
  • •Реактогенность бактерийных и вирусных препаратов
  • •Общая характеристика реактогенности
  • •Оценка и учет послепрививочных реакций
  • •Основные клинические формы поствакцинальных осложнении
  • •Иммуномодулирующие препараты
  • •Иммуностимулирующие препараты
  • •Нестероидные противовоспалительные препараты (нпвп)
  • •Иммунодепрессанты
  • •Задания к лабораторному занятию
  • •Министерство здравоохранения Украины Национальная фармацевтическая академия Украины Кафедра микробиологии
  • •1 Мл содержит 1 млрд микробных тел
  • •Иммунизация мышей антигеном.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий

Методы выделения чистых культур анаэробов.

· Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта-Тароцци.

· Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4-5мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду Китта-Тароцци.

· Метод Перетца. Готовят разведение материала, как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в чашку Петри, на дне которой на двух палочках лежит стеклянная пластина 6х6см. среду заливают так, что бы она заполнила пространство между пластиной и дном чашки. При появлении роста пластинку поднимают и чистые колонии пересевают.

5 МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР:

этапы выделения чистых культур аэробных бактерий:

1 — макро- и микроскопическое изучение исследуемого материала и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.

2 — макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;

3 — проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 — вывод о выделенной культуре.

В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов.

Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким.

Поскольку для культивирования анаэробных бактерий используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислорода и имеют низкий окислительно восстановительный потенциал (-20 -150 мВ), к их составу вводят индикаторы – резазурин, метиленовий синей и тому подобное, которые реагируют на смену этого потенциала. При его росте возобновлены бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин окрашивает среду в розовый цвет, а метиленовий синей – в голубой. Такие изменения свидетельствуют о невозможности использования сред для культивирования анаэробных микробов.

Способствует снижению окислительно восстановительного потенциала введения в среду не меньше 0,05 % агару, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это, в свою очередь, достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред.

Следует учесть, что через особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечно мозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитичний перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов росту, таких как твин-80, гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь.

Методы создания анаэробных условий. Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для облигатно-анаэробных бактерий, обязательным условием культивирования таких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это обеспечить.

Физические методы. 1. Перед посевом бактерий на питательную среду его обязательно регенерируют для удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15-20 мин на водяной бане, а затем быстро охлаждают к необходимой температуре.

2. Для предупреждения проникненя кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафином.

3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10-12 см). Кислород, как правило,дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов.

4. Эвакуационно заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметические металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксиду углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяной пары используют хлорид кальция, силикагель и тому подобное, которые помещают на дно анаеростата.

Химические методы. 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 N раствора гидроксида натрия.

Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия (Na2S2O4). Для связывания кислорода в 1 лвоздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % раствору Na2S2O4 и 16 мл 50 % гидроксида калия.

2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно восстановительного потенциала, к ним добавляются специальные восстановители:цистеин (0,03-0,0,5 %), тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия (0,01-0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара.

Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозних органов животных (печенка, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды).

Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют или электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин).

3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия вмикроанаеростатах, транспортных пластиковых пакетах и тому подобное. Одной из самых распространенных есть система “Gas Generating Box”. В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрию) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород.

Чашки с посевами помещаются в микроанаеростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатору. Кончик пакета “Gas Generating Box” надрезают ножницами, и у него наливают 10-15 мл воды. Пакет располагают вмикроанаеростати. Через 15-20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образовывая воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой.

Биологические методы. 1. Метод Фортнера. Метод заключается в совместном культивировании на одной средеаэробних и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезают полоску агару шириной до 0,5-1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, что содержит анаэробные возбудители, а из другого – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или “чудесная палочка”). Края чашки парафинируют или закрывают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии какаэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов.

2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей.

В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное.

За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трикомпонентноюгазовой смесью. Бактериолог работает в камере, находясь внешне, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные у нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом.

Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов

Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при по­мощи физических, химических и биологических методов.

Физические методы:

1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предот­вращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат. В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из гер­метически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи ва­куумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью.

Химические методы:

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде

2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства.

3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуоки­си углерода используют специаль­ные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологический метод

Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку герметично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлаж­денным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6×6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель меж­ду краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Ферменты бактерий.

2. Методы изучения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Дыхание бактерий.

4. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 16

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор– стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Контрольные вопросы

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и минеральных веществ. Источники азота, углерода. Факторы роста. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм? Особенности обмена веществ бактерий. Ферменты бактерий. Механизм расщепления веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Каковы типы питания патогенных микробов? Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Основные питательные среды. Специальные питательные среды, их названия; для каких бактерий предназначены? Элективные питательные среды, состав, применение. Приведите примеры. Дифференциально-диагностические среды, их названия; для чего применяются? Что такое рост микробов, размножение микробов? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде (начертить кривую). Размножение бактерий в непрерывно–проточной среде. Условия культивирования бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм? Особенности биологического окисления у микробов. Группы микробов по типу биологического окисления. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Перечислите патогенные анаэробы. Что такое окислительно-восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие — при более высоких? Типы брожения. Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Особенности культивирования анаэробных бактерий. Среды, методы и приборы, используемые для их культивирования. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего? Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов-аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов–анаэробов. Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальная температура для роста патогенных микробов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

В тетради перепишите схемы выделения чистых культур аэробов и анаэробов и впишите цель посева на каждом этапе.

Заполните таблицу «Культивирование анаэробов».

Способ культивирования Сущность способа Используемые
приборы методы среды
Физический
Химический
Биологический
Комбинированный

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Ознакомление с питательными средами. Изучите питательные среды и распределите их по назначению: основные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

2. Методы посева бактериальных культур с соблюдением правил асептики. Ознакомьтесь с особенностями техники пересева бактериальных культур на плотные и на жидкие питательные среды.

3. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов. Ознакомьтесь с методом получения изолированных колоний путем посева на чашке с питательной средой (демонстрация преподавателем). Из смеси бактерий приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Произведите посев смеси бактерий на чашку с питательной средой, укажите цель посева.

4. Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов. Ознакомьтесь с аппаратурой для культивирования анаэробов. Из посева на среде Китта–Тароцци приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем посева по методу Вейнберга в трубки Вейон-Виньяля.

ЗАНЯТИЕ 7

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Знание методов стерилизации необходимо врачу любой специальности. Поэтому следует тщательно изучить этот материал и знать конкретно методики, аппаратуру, режим стерилизации.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

— культуральные свойства микробов;

— понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике, методы стерилизации;

— устройство термостатов.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо знать:

— схему выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;

— условия, необходимые для культивирования микробов;

— характеристику роста микробов на плотных и на жидких питательных средах; морфологию колоний микробов, пигменты микробов.

Цель занятия

1. Изучить культуральные свойства бактерий.

2. Ознакомиться с особенностями бактериологического метода выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов.

3. Ознакомиться с основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.

План изучения темы

1. Повторите схему выделения чистой культуры бактерий – аэробов и анаэробов.

2. Понятие о культуральных свойствах микробов;

а) условия, необходимые для культивирования данного вида (питательная среда, рН, гН2, температура, аэробные или анаэробные условия);

б) характер роста данного вида микробов на питательных средах.

3. Пигменты микробов, их характеристика.

4. Методы стерилизации.

11. Методы культивирования анаэробных бактерий (методы создания анаэробных условий). Принципы выделения чистых культур анаэробных бактерий (методы Вейнберга и Цейсслера).

  • •5)Особенности строения спирохет, актиномицетов, риккетсий, хламидий и микоплазм. Методы их обнаружения. Значение в медицине.
  • •6.Особенности строения и жизнедеятельности вирусов и бактерий. Принципы классификации. Типы и фазы взаимодействия вирусов с клеткой. Вирусоскопический метод исследования.
  • •7. Типы и механизмы питания и дыхания бактерий. Ферменты бактерий и их классификация. Значение изучения ферментативной активности для идентификации бактерий.
  • •10. Рост и размножение бактерий. Характер роста на жидких и плотных питательных средах. Методы изучения сахаролитических и протеолитических свойств бактерий. Состав и назначение сред Гисса.
  • •11. Методы культивирования анаэробных бактерий (методы создания анаэробных условий). Принципы выделения чистых культур анаэробных бактерий (методы Вейнберга и Цейсслера).
  • •13. Генетические рекомбинации у бактерий: трансформация, трансдукция и конъюгация. Плазмиды и их роль в формировании лекарственной устойчивости и патогенного потенциала бактерий.
  • •14. Химиотерапевтические средства. Этиотропность и органотропность. Химиотерапевтический индекс. Антибиотики: классификация и механизм действия.
  • •15. Основные группы антибиотиков, применяемые в стоматологии. Способы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
  • •17.Нормальная микрофлора организма человека, ее значение. Дисбиозы. Пробиотики, пребиотики и синбиотики.
  • •18) Микрофлора воды. Оценка санитарного состояния воды. Методы определения микробного числа воды и выявления колиформных бактерий. Нормативы.
  • •19) Микрофлора воздуха. Оценка санитарного состояния воздуха закрытых помещений. Методы определения микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов. Расчет Омелянского
  • •20. Микрофлора почвы и ее значение. Показатели текущего санитарного надзора почвы. Методы определения общего микробного числа почвы и перфрингенс-титра почвы.
  • •21. Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса и его стадии. Формы инфекции. Стадии развития и характерные признаки инфекционной болезни.
  • •22.Роль макроорганизма и внешней среды в инфекционном процессе. Механизмы передачи инфекции.
  • •23.Патогенность и вирулентность. Характеристика факторов верулентности.Токсины бактерий.Их природа и свойства.
  • •24Серологический метод исследования. Реакция агглютинации (ра), механизм и методы постановки. Ингредиенты для их получение. Использование ра в диагностике инфекционных заболеваний.
  • •26.Реакция преципитации (рп), механизм и методы постановки (кольцепреципитация и преципитация в геле). Ингредиенты и их получение. Применение рп.
  • •27) Реакция связывания комплемента (рск). Механизм, компоненты, постановка и применение
  • •28) Реакции с применением меченных компонентов. Реакция иммунофлюоресценции (риф). Механизм, способы постановки, компоненты реакций и х применение.
  • •29) Иммунопроилактика и иммунотерапия. Медицинские иммунобиологические препараты, их классификация и действие на иммунную систему
  • •31) Убитые (инактивированные) корпускулярные (цельноклеточные и цельновирионные) вакцины. Определение и способы инактивации. Приготовление. Преимущества и недостатки. Примеры.
  • •32) Субкорпускулярные (химические, субъединичные) вакцины. Определение и получение. Преимущества и недостатки. Роль адъювантов. Примеры вакцин.
  • •33) Молекулярные вакцины. Определение. Получение анатоксинов, их примеры и применение. Единицы специфической активности анатоксинов. Ассоциированные вакцины, их достоинства и примеры.
  • •34) Сывороточные иммунные препараты: иммунные сыворотки и иммуноглобулины, их классификация. Получение, очистка, единицы активности антитоксических сывороток, их применение и примеры.
  • •35) Иммуномодуляторы: экзогенные, эндогенные, синтетические. Примеры и применение. Классификация по механизму действия. Иммунокорригирующая терапия.
  • •36) Микроскопический и микробиологический методы лабораторной диагностики инфекций. Сфера применения. Преимущества и недостатки.
  • •37) Серологический, аллергический и биологический методы лабораторной диагностики. Сфера применения, преимущества и недостатки.
  • •38) Молекулярно-генетические методы диагностики. Пцр: принцип метода, условия, основные этапы, сфера применения, преимущества и недостатки.
  • •39) Характеристика стафилококков. Заболевания, вызываемые патогенными стафилококками. Лабораторная диагностика. Лечение и профилактика. Роль носительства патогенных стафилококков в полости рта.
  • •41. Характеристика менингококков. Эпидемиология, патогенез, клиника и иммунитет при менингококковой инфекции. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика.
  • •43. Значение кишечной палочки для организма человека. Заболевания, вызываемые кишечной палочкой, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, лечение и профилактика.
  • •46. Характеристика возбудителей холеры. Эпидемиология, патогенез и клиника холеры. Лабораторная диагностика холеры. Экспресс- методы. Препараты для специфической профилактики и лечения холеры.
  • •47. Характеристика возбудителя ботулизма. Эпидемиология, патогенез и клиника заболевания. Диагностика, профилактика и лечение ботулизма.
  • •48. Характеристика возбудителя столбняка. Распространение в окружающей среде. Патогенез, клиника и принципы лабораторной диагностики столбняка. Препараты для специфической профилактики и лечения.
  • •49. Характеристика возбудителей газовой гангрены. Эпидемиология, патогенез, клинические формы заболевания. Принципы лабораторной диагностики. Препараты для специфической профилактики и лечения.
  • •50. Характеристика возбудителей неклостридиальной анаэробной инфекции. Микробиологическая диагностика. Лечение и профилактика.
  • •53. Характеристика возбудителя коклюша. Эпидемиология, патогенез, клиника и лабораторная диагностика заболевания. Препараты для специфической профилактики и лечения.
  • •54. Характеристика возбудителя чумы. Патогенез и клинические формы чумы. Принципы лабораторной диагностики заболевания. Препараты для специфической профилактики и лечения.
  • •55. Характеристика возбудителя туляремии. Эпидемиология, патогенез и клиника. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
  • •58. Характеристика возбудителя эпидемического возвратного тифа. Источник инфекции, пути передачи, патогенез и клиническая картина заболевания. Диагностика, лечение и профилактика заболевания.
  • •59. Характеристика возбудителя лептоспирозов. Источник инфекции, патогенез, диагностика, лечение и специфическая профилактика заболевания. Проявления в полости рта.
  • •61.Характеристика возбудителя урогенитального хламидиоза. Патогенез и принципы лабораторной диагностики заболевания. Профилактика и лечение.
  • •62.Характеристика вирусов гриппа. Эпидемиология и диагностика гриппа. Использование ртга для серотипирования вирусов гриппа. Препараты для специфической профилактики и лечения.
  • •64.Характеристика возбудителей вирусных гепатитов а и е. Патогенез гепатита а. Роль nk-клеток в патогенезе гепатита а. Диагностика и профилактика заболеваний.
  • •65.Характеристика возбудителей полиомиелита. Патогенез полиомиелита. Использование реакции нейтрализации в диагностике полиомиелита. Профилактика и лечение заболевания.
  • •67 Вирус кори. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика.
  • •69. Возбудитель бешенства. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профи лактика.
  • •71.Возбудитель амебиаза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение
  • •73. Понятие об асептике, антисептике, стерилизации, дезинфекции и консервации. Элементы асептики и виды антисептики. Методы дезинфекции. Вещества антисептики.
  • •75. Нетепловые физические методы стерилизации в стоматологии: уф-лучи, ионизирующее излучение, ультразвук, плазма. Аппаратура, стерилизуемый материал.
  • •76. Химическая стерилизация и дезинфекция в стоматологии. Дезинфицирующие вещества. Основные реагенты, применяемые для дезинфекции в стоматологии.
  • •78. Полость рта как экологическая ниша организма. Понятие о биопленках. Роль слюны в формировании постоянной микрофлоры ротовой полости.
  • •79. Основные представители резидентной микрофлоры полости рта, их свойства. Биопленка слизистой оболочки, протоков слюнных желез и слюны, десневого желобка и десневой жидкости, ротовой жидкости.
  • •80) Формирование зубной бляшки
  • •81) Факторы и механизмы неспецифической резистентности и специфического иммунитета в полости рта
  • •82) Особенности микрофлоры полости рта при кариесе зубов и ее роль в возникновении кариеса. Кариесогенные и кариесорезистентные виды. Вакцина для профилактика кариеса
  • •83) Этиология и патогенез одонтогенной инфекции. Микрофлора при пульпите
  • •84) Периодонтит и его виды, развитие и проявление. Микрофлора при остром и хроническом периодонтите. Причины развития системных заболеваний при хронических инфекциях полости рта
  • •85) Заболевания пародонта. Механизм развития. Участие иммунных факторов. Изучение роли бактерий-резидентов
  • •86. Микрофлора здорового пародонта и ее характерный сдвиг при гингивите и пародонтите.
  • •87. Характеристика пародонтопатогенных видов 1-ого и 2-ого порядков.
  • •88. Стоматиты: первичные и оппортунистические. Причины развития и микрофлора при оппортунистических стоматитах. Характеристика хронического рецидивирующего афтозного стоматита.
  • •90. Кандидоз слизистой оболочки полости рта. Характеристика возбудителей, причины развития, основные формы, клинические проявления. Методы лабораторной диагностики. Лечение.
  • •91. Бактериальные инфекции и их проявления в полости рта: скарлатина, дифтерия, листериоз, сифилис, гонококковый гингивостоматит, туберкулез, лепра.
  • •92. Вирусные болезни и их проявления в полости рта: острый и хронический герпетический стоматит, опоясывающий лишай, инфекционный мононуклеоз, корь, везикулярный стоматит, ящур.
  • •93. Формирование зубной бляшки на пломбировочных материалах. Основные штаммы и методы изучения адгезии микробов к материалам in vitro.

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор– стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.


Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.

Газ-пак (Generbaganaer). Система Generbaganaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Выделение чистой культуры бактерий — аэробов из материала, содержащего смесь микробов, занимаеткак правило 3 дня и производится по следующей схеме:

1 день — микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного по Граму — для предварительного ознакомления с микрофлорой данной смеси. Посев материала петлёй на чашку Петри с питательной средой штриховым методом для получения изолированных колоний. Засеянные чашки помещают в термостат на сутки.

2 день — изучение колоний, выросших на чашках, отбор изолированных колоний, описание их и микроскопия мазков из изолированных колоний (окраска по Граму) для проверки однородности микробов в колонии. Пересев изолированной колонии на скошенный агар для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат на сутки.

3 день — проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре, путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Контрольные вопросы.

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липоидов, углеводов, минеральных веществ. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм (катаболизм ианаболизм)? Особенности обмена веществ бактерий. Механизм расщепления бактериями питательных веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Какие типы питания имеются у патогенных микробов? Питательные среды — для чего применяются, каким требованиям они должны соответствовать? Классификация питательных сред по составу, по консистенции, по назначению. Обычные (простые) питательные среды. Специальные питательные среды, для чего применяются, принцип их действия. Дифференциально-диагностические среды, принципы их действия, для чего применяются, примеры. Что такое рост микроба? Что такое размножение микроба? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры. Размножение бактерий в непрерывно-проточной среде. Культивирование бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм, клон?Что такое колония микробов? Методы выделения чистой культуры бактерий. Рассказать поэтапно (по дням) выделение чистой культуры бактерий аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры анаэробов.

Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов

Для культивирования анаэробов необходимо создать с помощью физических, химических и биологических методов условия анаэробиоза — пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве.

Физические методы:

· механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы – анаэростатов (рис. 26, см. приложение), с помощью разрежающих насосов. Анаэростат представляет собой цилиндр из ударопрочного полимерного материала или металла с хорошо притертой крышкой, снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса;

· посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества, которые связывают растворенный в среде кислород. С целью уменьшения содержания кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, затем быстро охлаждают, после чего заливают небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Легко окисляемыми веществами являются глюкоза, лактоза и др. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая с успехом используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов;

· посев микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Для этого берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 500 С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде;

· замена воздуха в анаэростатах или эксикаторах индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в анаэростате или эксикаторе такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия;

Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую — анаэробов. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом (через 3-4 дня) — анаэробы.

Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий от потенциального носителя золотистого стафилококка (самостоятельная работа). Продолжить работу по бактериологическому исследованию, начатую на предыдущем занятии: рассмотреть чашку с выросшими колониями и обвести карандашом по дну различные типы колоний, у которых изучить культу­ральные свойства в соответствии с таблицей 3.

Учитываются следующие признаки колоний:

· размер (измеряется миллиметровой полоской со стороны дна диаметр колонии);

· форма (круглая, неправильная);

· цвет (красный, желтый и т.д.). Беспигментные колонии имеют отте­нок среды, например сероватый на МПА;

· поверхность (выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, шероховатая);

· край (ровный, изрезанный, волнообразный, фестончатый). Колонии зарисовать.

Таблица 3. Характеристика колоний бактерий

Признаки колоний Описание свойств колоний
Размер Проводится измерение диаметра колоний
Форма Круглая, неправильная
Цвет Красный, желтый и т.д. Беспигментные колонии имеют оттенок среды, например, сероватый на МПА
Поверхность Выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, морщинистая, шероховатая, исчерченная и т.д.
Структура Чашка Петри с ростом колоний кладется дном вверх на предметный столик микроскопа и колония изучается у ее края при малом увеличении с опущенным конденсором. Структура может быть гомогенной, мелко-, крупно-, неравномерно-зернистой, волокнистой
Край Изучается вместе со структурой. Может быть ровным, изрезанным, волнообразным, фестончатым
Консистенция Определяется при взятии петлей для приготовления мазка. Консистенция может быть слизистой (культура тянется – подозрение на наличие капсулы), влажная (легко берется) и сухая (крошится – подозрение на спорообразующие бактерии)
Тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства Изучаются соответствующие свойства бактерий, находящихся в колонии

Для дальнейшего изучения выбирают одну из колоний. С целью сохранения и накопления выделенной чистой культуры сделать пересев из колонии на скошенный МПА.

Техника пересева: снять крышку чашки, взять чашку в левую руку в вертикальном положении, посевом обратив к себе. Стерильной петлей взять из центра колонии культуру и засеять на скошенный МПА зигзагообразной линией, двигаясь снизу вверх. Прокалить петлю в пламени спиртовки, аккуратно подписать пробирку в верхней трети и поместить ее в термостат на сутки. Результаты исследования занести в протокол. Работа будет продолжена на следующем занятии.

6. Изучение методов культивирования анаэробов и ознакомление с аппаратурой, используемой с этой целью (демонстрация).

Культивирование анаэробов проводят в бескислородных условиях, для чего с целью удаления кислорода к питательным средам добавляют кусочки печени, а также редуцирующие вещества (сульфат железа, глюкоза и др.).

Наиболее широко в бактериологической практике применяются следующие методы культивирования анаэробов:

· Метод Вейнберга (на сахарном МПА столбиком). В расплавленный МПА в пробирке бактериологической иглой или петлей добавляют исследуемый материал, тщательно перемешивают содержимое пробирки, охлаждают. В нижней части пробирки создаются оптимальные условия для роста анаэробов,

· Метод Вейон-Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в нескольких пробирках с МПА, затем содержимое каждой пробирки набирают в специальную стеклянную трубку, один конец которой вытянут в виде капилляра (как у пастеровской пипетки), а другой конец имеет сужение. После заполнения трубки капилляр запаивают в пламени спиртовки, а суженную часть трубки закрывают кусочком ваты. Трубку охлаждают, помещают в термостат. Через 2-3 дня в столбике МПА вырастают колонии анаэробов. Напильником делают надрез выше уровня намеченной колонии, трубку надламывают, колонию извлекают из агара петлей и пересевают на среду Китт-Тароцци.

· Выращивание в анаэростатах — в металлических или пластмассовых сосудах с герметически закрывающейся крышкой, воздух из которых отсасывается с помощью разрежающего насоса или заменяется газовым составом.

· Создание анаэробных условий в эксикаторах (герметически закрывающиеся стеклянные сосуды) с использованием химических поглотителей кислорода или заменой кислорода инертным газом.

· Биологический метод культивирования анаэробов (по Фортнеру). На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую — анаэробов. Бортики чашки оклеивают лейко­пластырем, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом анаэробы.

2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий из почвы (демонстрация):

· изучение характера роста на среде Китт-Тароцци;

· изучение морфологических и тинкториальных свойств микроор­ганизмов, выросших на среде Китт-Тароцци; приготовление мазка, окраска его по Граму, микроскопия. Обратить внимание на наличие в микропрепарате крупных, расположенных беспорядочно или короткими цепочками, грамположительных палочек; выполнить посев одной петли материала со среды Китт-Тароцци в высокий столбик МПА, расплавленного на водяной бане и остуженного до 45° С. Результаты исследования занести в протокол.

3. Выделение чистой культуры протея по методу Шукевича (самостоятель­ная работа). Произвести посев исследуемого материала петлей в конденсацион­ную воду скошенного МПА. Ход исследования отразить в протоколе.

22. Методы выделения чистых культур аэробов.

Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку перевора­чивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18—24 ч.

Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолиро­ванные колонии, обращая внимание на их форму, величину, кон­систенцию и другие признаки. Для определения морфологии кле­ток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пе­ресевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии сни­мают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чис­той культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашен­ного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнару­живаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего неко­торым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

23. Методы выделения чистых культур анаэробов.

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребно­стям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адек­ватно редуцированными

Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэроб­ных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные сре­ды (тиогликолевую, Китта — Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высо­кий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий го­товят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта — Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (кло­стридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения веге­тативных клеток посторонней микрофлоры, которая может при­сутствовать в исследуемом материале

24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологиче­ская, генетическая.

???

Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.

25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов.

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных

продуктов.

Карбогидразы- ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:

а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;

б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);

в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

Протеазы-ферменты, разлагающие белки:

а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);

б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;

в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;

г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;

д) для выявления уреазы — фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы — ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Ферменты-токсины: Гемолизины — ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.

Цитотоксины- ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.

Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.

Ппазмокоагулаза- фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа — см. выше.

Оксидо-редуктазы:

1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).

2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.

3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.

4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК),Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.

В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:

Колонии —- Приготовление —- Внесение —— Инкубация —- Учет(+ -) —- Интер-

суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду

В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор «АТВ») или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде «+» или «-» и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной

микроорганизм.

Механические и биологические методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных бактерий

Механические методы выделения чистых культур аэробных ифакультативно-анаэробных бактерий основаны на механическом разобщении бактериальных клеток на поверхности твердых питательных сред (рис.7). Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. К механическим методам относятся:

1) метод Дригальского – это качественный метод, широко применяется для бактериологической диагностики инфекционных заболеваний;

2) метод пластинчатых разводок Коха – это количественный метод, применяется в санитарной микробиологии;

3) метод клонов – получение колоний из одной бактериальной клетки (клонирование).

Биологические методы – методы, основанные на биологических свойствах бактерий:

1)метод Щукевича. Исследумый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА. Данный метод культивирования применяется при подозрении на инфицирование бактериями рода Proteus (P. vulgaris). В случае роста P. vulgaris обнаруживается ползучий рост – рост по всей поверхности агара за счет выраженной подвижности (рис. 8).;

2) бактериостатический метод, основанный на различном действии некоторых химических веществ (например, 5% серная кислота быстро убивает большинство микробов, а микобактерии туберкулеза выживает в этих условиях) и антибиотиков на бактерии (например, небольшие концентрации пенициллина задерживает рост грамположительных бактерий и не влияет на грамотрицательные;

3) метод прогревания. При прогревании исследумого материала при 80°С в течение 10-15 минут вегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняются;

4) метод обогащения. Исследумый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Например, культивирование стафилококков на желточно-солевом агаре.

5) культивирование в организме лабораторных животных, например, выделение чистой культуры возбудителя чумы (Y. рestis) из материала, загрязненного посторонней микрофлорой, возбудителя туляремии (Fr. tularensis). Бактериологическая диагностика туляремии имеет существенную особенность – выделить возбудителя от больного человека непосредственными высевами не удается, тат как накопление микроба в крови и тканях больных крайне незначительно, поэтому бактериологическое исследование начинают с заражения лабораторных животных, то есть с обогащения биологическим способом.

6) культивирование вирусологическими методами (заражение куриного эмбриона, тканевых культур, чувствительных животных) облигатных внутриклеточных паразитов: риккетсий, хламидий, факультативных паразитов. Например, микоплазмы – мембранные паразиты, очень требовательны к питательным средам, растут на сложных питательных средах с добавление холестерина, жирных кислот, белка, углеводов и др., растут медленно, образуют колонии, напоминающие «яичницу – глазунью», то есть более гомогенным приподнятым центром и ажурными плоскими полупросвечивающими краями (рис.9). Можно их культивировать на клеточных культурах и куриных эмбрионах.

Метод Дригальского

Цель метода: Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и их идентификации.

Исследуемыми материалами могут быть мокрота, гной, испражнение и др. в зависимости от локализации возбудителя инфекционного заболевания. Метод проводится в 4 этапа, при выделении гемокультуры – 5 этапов. Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий изучаем на примере выделения чистой культуры кишечной палочки (E coli) из ее смеси со стафилококком.

1-й этап.Получение изолированных колоний. Колонии – это размножившиеся особи одной бактериальной клетки, выросшие на поверхности твердой питательной среды в виде изолированного скопления.

Ход работы:

а) приготовление мазков из данной смеси микробов и окраска по Граму. Под микроскопом видны грамотрицательные кишечные палочки и грамположительные стафилококки ;

б) рассев смеси на чашку с МПА шпетелем (рис.10). Мы засеваем несколько измененным методом Дригальского. Вместо 3-х чашек с МПА берем одну. На поверхность питательной среды в чашке наносят петлёй каплю исследуемого материала в 3-х точках: первые две точки – ближе к стенке чашки, а третью точку – в центре, которую растирают прокаленным и охлажденным шпателем сначала в одном направлении, затем перпендикулярно в другом направлении (рис.11). Чашку надписывают (фамилия студента, номер группы, дата) и ставят в специальный цилиндр вверх дном, чтобы образующиеся капельки паров воды, попадающие на крышу, не стекали на поверхность среды и не размазывали посева;

Рис.11.

в) инкубация посева в термостате при 370 в течение 18-24 часов.

2-й этап.Выделение чистой культуры, то есть культуры, содержащей одного вида бактерий.

Ход работы:

а) макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске, характеру поверхности и краев, консистенции, структуре и размеру.

Просматривают чашку (не открывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20-30 см. Видно, что посев смеси дал рост неоднородных колоний. Колонии стафилококка выпуклые, гладкие, блестящие, с ровным краем, размером 1-4 мм в диаметре, прозрачные, золотистые или белого цвета (рис.12). Колонии кишечной палочки слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватого цвета, с ровным краем и гладкой блестящей поверхностью, размером 2-3 мм в диаметре (рис.13).

Колонии можно просмотреть с помощью лупы или под микроскопом (при малом увеличении) при этом лучше видна разница в структуре колоний;

б) микроскопическое исследование колоний.

Выбирают изолированные колонии того и другого микроба, из части каждой колонии делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Убеждаются, что золотистого цвета колонии содержат стафилококки — кокки располагаются скоплениями, грамположительны (рис.14), а серого цвета колонии — кишечные палочки, беспорядочно расположенные, грамотрицательные (рис.15);

в) остатки колоний кишечной палочки и стафилококков пересевают в пробирки с косым агаром. К пробиркам прикрепляют этикетку с указанием даты посева, группы, фамилии студента;

г) инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.

3-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры.

Ход работы:

а) макроскопическое определение роста культуры на скошенном МПА. Стафилококк на скошенном агаре растет в виде прозрачного налета золотистого или белого цвета, кишечная палочка — в виде сочного, блестящего, полупрозрачного налёта серого цвета;

б) проверка чистоты культуры. Готовят мазок, окрашивают его по Граму и просматривают под микроскопом (не менее 10 полей зрения). Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально;

в) идентификация выделенной чистой культуры бактерий проводится по биохимическим, антигенным свойствам, фагочувствительности, токсигенности (вирулентности) и по генетической структуре.

Идентификация E.coli по биохимическим признакам:

а) идентификация по сахаролитической активности E.coli проводится по изменению короткого «пестрого» ряда, который включает в себя среды Гисса (МПБ, 0,5% углеводов: лактозы, сахарозы, глюкозы, мальтозы, маннита и индикатр Андреде-кислый фуксин; в каждую пробирку помещают » поплавок» — стеклянные трубочки, запаянные с одного конца для улавливания газа; покраснение среды является показателем образования кислоты при ферментации углеводов). Исследуемую культуру засевают на среды «пестрого» ряда и инкубируют при 370 в теч. 18-24 часов. E.coli ферментирует всех углеводов короткого «пестрого» ряда до кислоты и газа, за исключением сахарозы (рис.16) и в отличие от других представителей семейства Enterobacteriaceae, например, возбудителей брюшного тифа и паратифов А и В: S. typhi, S.P.A и S.P.B. S. typhi ферментирует всех углеводов короткого «пестрого» ряда до кислоты за исключением сахарозы и лактозы (рис.17), паратифозные палочки — тех же углеводов, но с образованием кислоты и газа.

б) идентификация по протеолитической активности.

Разложение микробами белка сопровождается образованием индола, сероводорода, аммиака.

Реакция на сероводород.Исследуемую культуру засевают в МПБ, под пробкой укрепляют полоску бумаги, пропитанной ацетатом свинца. Почернение бумаги после инкубации при 370 в течение 2-3 суток свидетельствует о наличии сероводорода. E.coli не образует сероводород в отличие от возбудителей брюшного тифа и паратифа В.

Проба на индол: Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2-3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлороводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание; при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо.

Идентификация стафилококков по биохимическим признакам:

а) определениекаталазной активности

На предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков O2 свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы. Каталазной активностью обладают стафилококки в отличие от стрептокков;

б) определение плазмокоагулазной активности.Плазмокоагулаза – фермент S.aureus сворачивающий фибрин за счет активации предшествующего в плазме крови протромбина, тем самым, защищая бактерии от клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

В пробирку с цитратной плазмой вносят исследуемую культуру, помещают в термостат при (37 +/- 1) °С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. S.аureus обладает плазмокоагулазной активностью в отличие от других стафилококков.

4-й этап.Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.

Например, выделена чистая культура E.coli (S. аureus), идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам, токсигенности (вирулентности), фагочувствительности и по генетической структуре.

Особенности и принципы выделения чистых культур бактерий

Чистой культурой считается совокупность микроорганизмов, принадлежащих к одному виду. Получение данного материала является необходимым моментом исследования в выполнении лабораторных диагностических методик. Для выделения чистых культур бактерий используют мазки из крови, мокроты, фекалий, исследуют гнойный, а также другой биологический материал. В естественных условиях (в воздухе, воде, почве), продуктах пищевого назначения, в трупах (человеческих, животных) содержатся ассоциации различных видов микроорганизмов.

Отделение чистой культуры важно для подробного изучения свойств микробов: морфологических, культуральных, биохимических, а также антигенных. По результатам данных методик исследования можно установить принадлежность возбудителя к определенному виду и типу, иными словами, выполнить его идентификацию.

Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры

Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.

  1. Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
  2. Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
  3. Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
  4. Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
  5. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
  6. Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
  7. Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
  8. Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Методики проведения оценки возбудителя

Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.

Методика Пастера

Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.

Методика Коха

Известна также как методика «пластинчатых разводок». Представляет собой разведение материала для исследования в агаре (в расплавленном состоянии с температурой 48-50°С). Далее полученный состав разливают по чашкам Петри, где он должен застыть.

Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.

Методика Шукевича

Используется при необходимости выделить чистую культуру аэробов протея либо каких-либо других микробов, характеризующихся «ползучим» ростом. Сеют культуры на воду, конденсированную у основания скошенного агара.

При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.

Методика Дригальского

Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.

Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.

Методика Вейнберга

Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.

При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.

Методика Хангейта

Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.

Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.

Микроманипулятор

Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.

Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.

Метод Дригальского: этапы выделения чистой культуры и ее идентификации

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *