Репарация генетического материала

Репарация ДНК

Репликация обеспечивает самокопирование генетического материала. При этом, благодаря принципу комплементарности, весьма высока точность сопоставления нуклеотидных последовательностей дочерней цепи к матричной ДНК. Кроме того, ДНК — достаточно химически инертное вещество, что обеспечивает ее большую стабильность по сравнению, например, с РНК. Однако этого мало, так как ДНК все же может повреждаться внешними воздействиями, также могут возникать ошибки на этапе репликации. Поэтому в клетках должны существовать механизмы исправления повреждений и ошибок синтеза, т. е. выполняться репарация ДНК.

Существует целый ряд репарационных механизмов, выполняющихся на различных этапах синтеза ДНК, а также в зависимости от типа возникающих ошибок.

Все вместе репарационные механизмы существенно снижают частоту ошибок в молекулах ДНК и направлены на поддержание стабильности наследственного материала. Однако, поскольку не все изменения структуры ДНК устраняются, возникают мутации, благодаря которым на Земле возникло разнообразие живых организмов.

Устранение ошибок ДНК-полимеразой

Прежде всего сама ДНК-полимераза при наращивании новой цепи ДНК проверяет, тот ли нуклеотид присоединяется к растущей нити.

Существуют измененные формы азотистых оснований, которые могут комплементарно связываться с нуклеотидами матрицы. Так измененная форма цитозина может связаться с аденином. Полимераза присоединит этот конечный нуклеотид к растущей цепи, но он быстро перейдет в свою обычную форму — станет обычным цитозином. При этом водородные связи разрушаются (т. к. нарушается комплементарность), и на конце получается неспаренный нуклеотид, однако ковалентно соединенный с синтезируемой цепью. Полимераза не может далее наращивать цепь. Сама полимераза или связанный с ней фермент редактирующая эндонуклеаза отщепляют последний «неправильный» нуклеотид.

В результате такого механизма самокоррекции частота ошибок репликации снижается в 10 раз. Если присоединение ошибочного нуклеотида на этапе синтеза ДНК составляет 10-5, то репарационная активность полимеразы снижает их количество до 10-6.

Репарационные механизмы

ДНК-полимераза исправляет часть ошибок репликации, но не все. Кроме того, изменения в последовательности нуклеотидов ДНК возникают и после ее удвоения. Так могут теряться пуриновые основания (аденин и гуанин), дезаминироваться цитозин, превращаясь в урацил. Эти и другие изменения возникают обычно из-за содержащихся в окружающей хромосомы среде определенные химически активных вещества. Ряд подобных соединений нарушает нормальное спаривание оснований. Под действием ультрафиолетового излучения два соседних остатка тимина могут образовать связи между собой, возникают тиминовые димеры.

Существует прямая репарация, когда, если это возможно, ферментативно восстанавливается исходная структура нуклеотидов, без их вырезания.

Эксцизионная репарация

Эксцизионная, или дорепликативная, репарация осуществляется до очередного цикла репликации.

Существует класс ферментов, обнаруживающих измененные последовательности нуклеотидов в одной из комплементарных цепей ДНК. После этого происходит удаление ошибочного участка и его замена вновь синтезированным. При этом матрицей служит участок комплементарной «правильной» нити.

Ферменты репарации обычно обнаруживают ошибки на новой нити ДНК, а не матричной. Между двумя цепями одной молекулы ДНК небольшое различие, заключающееся в степени метилирования азотистых оснований. У дочерней цепи оно отстает от синтеза. Ферменты распознают такую цепь и именно на ней исправляют участки, которые так или иначе не комплементарны участкам старой цепи. Кроме того, сигналами могут служить разрывы нити, которая у эукариот синтезируется фрагментами.

Фермент эндонуклеаза способна обнаруживать утрату пуриновых оснований. Данный фермент разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения. Далее действует фермент экзонуклеаза, который удаляет участок, содержащий ошибку. После этого дыра застраивается согласно комплементарности матрице.

ДНК-гликозилазы – целый класс ферментов, распознающих повреждения ДНК в результате дезаминирования, алкилирования и других структурных изменений ее оснований. Гликозилазы удаляют именно основания, а не нуклеотиды. После этого участки нити ДНК без оснований репарируются также как при «починке» пуринов.

Следует отметить, что дезаминирование азотистых оснований может привести к невозможности восстановления исходной последовательности нуклеотидов. Происходит замена одних пар оснований другими (например, Ц-Г заменится на Т-А).

Ферменты, удаляющие участки с тиминовыми димерами, распознают не отдельные ошибочные основания, а более протяженные участки измененной ДНК. Здесь также происходит удаление участка и синтез на его месте нового. Кроме того димеры тимина могут устраняться самопроизвольно под действием света — так называемая световая репарация.

Пострепликативная репарация

Если дорепликативная репарация не исправила измененные участки ДНК, то в ходе репликации происходит их фиксация. Одна из дочерних молекул ДНК будет содержать изменения в обоих своих нитях. В ней одни пары комплементарных нуклеотидов заменены на другие, или появляются бреши во вновь синтезированной цепи напротив измененных участков матричной.

Система пострепликативной репарации способна распознавать такие изменения ДНК. На этом этапе устранение повреждений ДНК осуществляется путем обмена фрагментами (т. е. рекомбинацией) между двумя новыми молекулами ДНК, одна из которых содержит повреждение, другая — нет.

Так происходит с димерами тимина, которые не были удалены на предыдущих этапах. Между двумя рядом стоящими тиминами присутствуют ковалентные связи. Из-за этого они не способны связываться водородными связями с ковалентной цепью. В результате, когда на матричной цепи, содержащей тиминовый димер, синтезируется дочерняя цепь, в ней образуется брешь. Этот разрыв распознается ферментами репарации. Понятно, что правильного участка у данной молекулы ДНК нет (одна нить содержит тиминовый димер, другая — дыру). Поэтому единственный выход — это взять участок ДНК со «здоровой» молекулы, который берется с матричной цепи этой молекулы ДНК. Образующаяся здесь дыра заполняется по принципу комплиментарности.

SOS-система

Значительная часть повреждений ДНК устраняется с помощью описанных репарационных механизмов. Однако если ошибок остается слишком много, то обычно включается так называемая SOS-система, состоящая из своей группы ферментов, которые могут заполнять дыры, не обязательно соблюдая принцип комплементарности. Поэтому срабатывание SOS-системы часто служит причиной возникновения мутаций.

Если же изменение ДНК слишком существенное, то репликация блокируется, и клетка не будет делиться.

Пострепликативная репарация (прр)

Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров. Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими дуплексами. При этом до 50% УФ-индуцированных димеров переносятся из родительской ДНК в дочернюю. В клетках E. coli процесс ПРР контролируется, по крайней мере, 17 генами.

Известны два пути рекомбинационной репарации пострепликативных пробелов в ДНК, совпадающих с путями, осуществляющими у E. coli рекомбинацию между ДНК донора и реципиента при конъюгации, трансформации и трансдукции. Основным является путь RecBC, запасным — путь RecF. Оба они контролируются геном recA. Пробелы в дочерних цепях заполняются в результате рекомбинации, а пробелы в родительских цепях — путем репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразами I либо III. В отсутствие их обеих ресинтез идет под действием ДНК-полимеразы II. Другой путь ПРР использует механизм реципрокной рекомбинации, в результате которой димер оказывается в дочернем дуплексе, а пробел напротив него — в родительском. Этот путь включает: 1) образование двунитевых разрывов вследствие случайных разрывов рядом с димерами в родительских цепях; 2) реципрокные рекомбинационные обмены между двумя сестринскими дуплексами в гомологических областях; 3) завершение рекомбинации с образованием ДНК, свободной от повреждений.

Оба типа рекомбинационной репарации ДНК осуществляются ферментами, действующими конститутивно, и в зависимости от вида бактерий репарируют от 30 до 100% пострепликативных пробелов.

Индуцируемая репарация

SOS-репарация. М. Радман (1974) и Э. Виткин (1975) первыми указали на возможную взаимосвязь нескольких феноменов, наблюдаемых в УФ-облученных клетках E. coli. К ним относятся: 1) индукция профага  — процесс, требующий инактивации репрессора; 2) феномен W-реактивации, открытый Дж. Вейглем (1953) и выражающийся в повышении выживаемости и мутабильности УФ-облученного фага  при заражении им предварительно облученных клеток E. coli по сравнению с выживаемостью фага в необлученных клетках; 3) образование длинных нитей (филаментов) неразделившихся бактерий вследствие блокирования нормального процесса клеточного деления в облученных клетках; 4) выключение клеточного дыхания; 5) индукция мутагенеза, и ряд других.

Способность клетки реагировать на повреждения ДНК или прекращение ее синтеза путем активации группы генов, контролирующих перечисленные выше феномены, получила название SOS-ответа. Одна из форм SOS-ответа — SOS-репарация ДНК. Помимо УФ-облучения сигналами на включение SOS-репарации могут служить и другие воздействия, повреждающие ДНК.

В случае УФ-облучения индукция SOS-репарации у E. coli происходит тогда, когда в геноме находится не менее 30-60 невырезанных димеров. Возникающая задержка репликации, по-видимому, активирует группу генов, продукты которых обеспечивают SOS-репарацию ДНК. Ее характерная черта — неточность восстановления первичной структуры ДНК, поэтому такой тип репарации называют “склонной к ошибкам” в отличие от относительно безошибочной эксцизионной репарации.

По мнению ряда исследователей, в основе SOS-репарации лежит индукция новой или модификация одной из предсуществующих ДНК-полимераз, обеспечивающих возможность “трансдимерного” синтеза ДНК, в результате которого напротив димера будет находиться не брешь, а какой-то нуклеотид. Такая произвольная подстановка нуклеотида во вновь образующуюся нить может привести к мутации. Прямые доказательства этой гипотезы отсутствуют, однако существование мутагенной репарации выявлено у фага Т4 и грибов, различных видов дрожжей, у D. melanogaster. Обнаружена она и у млекопитающих, для которых установлено, что пострепликативные бреши действительно могут заполняться за счет синтеза ДНК, а не в результате рекомбинации. Примечательно, что в отличие от конститутивной безошибочной эксцизионной репарации SOS-репарация сопряжена с синтезом белка de novo и происходит в богатой питательной среде. Это соответствует условиям, ведущим к фиксации мутаций в УФ-облученных клетках E. coli.

Общее свойство всех SOS-ответов у E. coli — их абсолютная зависимость от активности генов recA и lexA. Первый из них кодирует синтез белка-индуктора SOS-системы, второй — белка-репрессора гена recA и ряда других генов, кодирующих SOS-функции. Продукт гена recA — RecA-белок- полипептид (Мr 37 842), обладающий несколькими формами ферментативной активности. Главная для регуляции SOS-ответа — протеолитическая: RecA расщепляет или стимулирует аутопереваривание белка LexA и репрессоров генов ряда SOS-функций, например репрессора фага , поддерживающего его в состоянии профага. Помимо протеазной активности RecA-белок обладает еще и АТФ-азной и хеликазной формами активности, важными для его участия в процессах рекомбинации и рекомбинационной ПРР ДНК. При отсутствии индуцирующих воздействий исходный сравнительно низкий уровень белка RecA в клетках E. coli составляет 800-1200 молекул на клетку. Однако в условиях индукции SOS-системы синтез белка RecA резко усиливается и может достигнуть 30% от общего содержания белка в клетке. Другой важнейший для функционирования SOS-системы ген — lexA, — кодирует белок с Мr 22 700.

Ключевую роль в регуляции SOS-системы играет взаимодействие белков RecA и LexA. В интактной клетке исходный уровень белка RecA обеспечивает рекомбинацию, но его недостаточно для индукции SOS-функций. В неповрежденной клетке возможность избыточной продукции белка RecA подавлена (репрессирована) белком LexA. Повреждения ДНК активируют RecA-протеазу, переваривающую LexA-репрессор. Это, в свою очередь, приводит к индукции других генов SOS-системы, репрессоры которых также расщепляются белком RecA. По мере того как количество молекул RecA-протеазы исчерпывается, вновь синтезируется интактный LexA-репрессор и вся SOS-система выключается. Из этой модели следует, что SOS-система является саморегулирующейся, причем белок RecA ее позитивный, а белок LexA — негативный регулятор. Таким образом, SOS-ответ клетки складывается из следующих этапов: индуцирующий сигнал, синтез RecA-белка и его активация, разрушение репрессоров и индукция SOS-функций.

По мере репарации ДНК факторы, индуцирующие SOS-ответ, элиминируются и в течение 30-60 мин после индуцирующего воздействия RecA-протеаза инактивируется. Синтез белка LexA, однако, продолжается и, так как теперь ничто не мешает его функционированию, происходит репрессия генов SOS-системы. Клетка возвращается в неиндуцированное состояние.

Из почти 20 генов, контролирующих SOS-функции клетки у E. coli, для мутагенеза существенны лишь гены recA, lexA и состоящий из двух генов оперон umuDC. Мутации в любом из генов этого оперона подавляют мутагенез, индуцированный УФ-лучами, метилметансульфонатом и другими видами воздействия. В случае повреждения ДНК RecA-протеаза расщепляет репрессор оперона umuDC и последний начинает функционировать. Предполагается, что продукты, кодируемые генами umuDC, каким-то образом модифицируют клеточные ДНК-полимеразы, в результате чего они осуществляют синтез ДНК в обход димеров пиримидина.

Адаптивный ответ. Помимо SOS-репарации в клетках E. coli действует еще один путь индуцируемой репарации ДНК, называемый адаптивным ответом на действие алкилирующих агентов. В отличие от SOS-репарации адаптивный ответ recA — независим. Адаптивный ответ наблюдается в случае, если клетки до обработки основной, большой, дозой алкилирующих агентов (например, нитрозогуанидина либо N-метил-N-нитрозомочевины) подвергаются воздействию очень низких, нелетальных доз тех же соединений. Предобработка бактерий низкими дозами алкилирующих агентов обусловливает индукцию ферментов репарации, специфично действующих на алкилирование ДНК. Один из этих ферментов — индуцируемая О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза — переносит метильную группу с О6-метилгуанина (основного предмутационного повреждения в алкилированной ДНК) на остаток цистеина, входящий в состав самого фермента, и тем самым непосредственно исправляет повреждение ДНК. Другой фермент — индуцируемая ДНК-гликозилаза — удаляет ряд потенциально летальных повреждений в ДНК, включая 3-метиладенин, 3-метилгуанин и др.

Системы индуцируемой репарации ДНК действуют не только у прокариот, но и эукариот. Так, гены, функционально близкие к генам, контролирующим SOS-функции у E. coli, обнаружены у дрожжей. Индукция ферментов, приводящих к снижению мутагенного эффекта и увеличению выживаемости в случае предобработки малыми дозами алкилирующих агентов, описана у крыс. У млекопитающих известны и другие индуцируемые ферменты, связанные с повреждениями ДНК. Однако обнаружить индуцируемую систему репарации ДНК, приводящей к увеличению клеточного мутагенеза у млекопитающих, пока не удалось.

Репарация генетического материала. Дорепликативная репарация световая. Темновая эксцизионная репарация. Примеры. Мутации, связанные с нарушением репарации. Мутон.

⇐ ПредыдущаяСтр 30 из 122

Репарация— особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.


Световая репарация.


Начало изучению репарации было положено работами А. Келнера США, который в 1948 обнаружил явление фотореактивации ФР — уменьшение повреждения биологических объектов, вызываемого ультрафиолетовыми УФ лучами, при последующем воздействии ярким видимым светом световая репарация. В 1958 году была выделена фотолиаза, осуществляющая фотореактивацию.

Механизм: под влияние УФ-лучей образуются димеры пиримидиновых оснований тимина , цитозина, тимино — цитозиновые. Фотолиаза расщепляет вновь образующиеся связи между пиримидиновыми основаниями и восстанавливает структуру ДНК. Свет активирует фотолиазу, которая узнает димеры облученной ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникающие связи.

Темновая репарация.


Позднее при изучении генетического контроля чувствительности бактерий к УФ-свету и ионизирующим излучениям была обнаружена темновая Р. — свойство клеток ликвидировать повреждения в ДНК без участия видимого света. Механизм темновой Р. облученных УФ-светом бактериальных клеток был предсказан А. П. Говард-Фландерсом и экспериментально подтвержден в 1964 Ф. Ханавальтом и Д. Петиджоном США. Было показано, что у бактерий после облучения происходит вырезание поврежденных участков ДНК с измененными нуклеотидами и ресинтез ДНК в образовавшихся пробелах. Специфические ферменты узнают поврежденный участок ДНК и вырезают его.

Различают дорепликативную репарацию, которая завершается до начала репликации хромосомы в поврежденной клетке, и пострепликативную репарацию, протекающую после завершения удвоения хромосомы и направленную на ликвидацию повреждений как в старых, так и в новых, дочерних молекулах ДНК. Считается, что у бактерий в пострепликативной репарации важная роль принадлежит процессу генетической рекомбинации.


Мутон— обычно определяется как единица мутации.


При возникновении спонтанной или индуцированной мутации в пределах структурного гена цистрона аминокислотный состав синтезируемого белка может измениться; иногда изменение в молекуле белка касается лишь одного аминокислотного остатка. Таким образом мутону, как единице мутации соответствует триплет ДНК, состоящий из трёх нуклеотидов, то есть кодон.


Однако, если мутация связана с изменением не одного, а нескольких аминокислотных остатков в молекуле белка, то тогда мутону будет соответствовать не один, а несколько триплетов, входящих в состав цистрона ответственного за синтез данного белка.

Рекон — наименьший неделимый элемент в нитевидной структуре ДНК, который может быть подвержен спонтанной или индуцированной мутации.


Мутации подвергается участок ДНК, ответственный за синтез определённого белка — цистрон. Сам цистрон состоит из более мелких единиц мутации — мутонов соответствует кодону — триплету, кодирующему аминокислоты. Однако, мутация может затронуть и отдельный нуклеотид, являющийся элементарной единицей

генетической информации. В терминах классической генетики эти единицы соответствуют реконам.

Мутации

Считается, что нарушение механизмов репарации ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение. На сегодняшний день известен ряд наследственных заболеваний, причиной которых служат нарушение репарации ДНК. Дефекты системы эксцизионной репарации нуклеотидов приводят к возникновению пигментной ксеродермы, синдрома Кокейна и трихотиодистрофии. Наследственный неполипозный рак толстой кишки может вызываться мутациями некоторых генов системы репарации гетеродуплексов. Многие синдромы предрасположенности к онкологическим заболеваниям — ретинобластома, семейный аденоматозный полипоз и т.п. — связаны с нарушениями систем ответа на повреждение ДНК.


№32 Репарация генетического материала. SOS — репарация. Пострепликативная репарация.

Репарация генетическая — процесс устранения генетических повреждений и восстановления наследственного аппарата, протекающий в клетках живых организмов под действием специальных ферментов.

SOS-репарация


При ней индуцируется синтез белка, который присоединяется к ДНК — полимеразному комплексу и делает возможным строить дочернюю ДНК напротив дефектных звеньев матричной цепи. В результате ДНК удвоена, с ошибкой, но это дает провести клеточное деление.


Пострепликативная репарация


Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка

Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщемлять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.

Характеристика наследственного материала в митотическом цикле клетки. Химический состав и структурная организация хроматина. Морфология хромосом. Хромосомы типа ламповых щеток. Полимерные хромосомы.

Характеристика наследственного материала в митотическом цикле клетки


Клеточный цикл эукариот состоит из двух периодов:


1.Период клеточного роста, называемый интерфаза, во время которого идет синтез ДНК и белков и осуществляется подготовка к делению клетки.


2.Периода клеточного деления, называемый фаза М от слова mitosis — митоз.


Интерфаза состоит из нескольких периодов:


G1-фазы от англ. gap — промежуток, или фазы начального роста, во время которой идет рост клеток, синтез белков, РНК, происходит подготовка клеток к синтезу ДНК, повышается активность ферментов

S-фазы от англ. synthesis — синтез, во время которой идет репликация ДНК клеточного ядра, также происходит репликация молекул ДНК, синтез белков — гистонов.


G2-фазы, происходит синтез РНК, накапливается энергия в молекулах АТФ, завершается удвоение центриолей, митохондрий, пластид, синтезируются белки, заканчивается рост клетки.


Митоз:

1.Профаза. Ранняя профаза. В клетке плазматическая мембрана на фотографии имеет красный цвет исчезает ядерная оболочка, нити микротрубочек зеленые начинают формировать митотический аппарат веретено деления, хроматин комплекс ДНК и белков-гистонов, на фотографии — голубые пятна начинает конденсироваться и, спирализуясь, превращаться в хромосомы. Поздняя профаза. Продолжается формирование хромосом из хроматина, на полюсах бывшего ядра формируются центры митотического аппарата, между которыми протягиваются микротрубочки нитей веретена деления.

2.Метафаза. Хромосомы располагаются по экватору бывшего ядра, прикрепляясь своими центромерами первичными перетяжками к нитям митотического аппарата. Начинается формирование метафазной пластинки. Заканчивается формирование метафазной пластинки. Именно на этой стадии клеточного деления, блокировав дальнейшее расхождение хромосом при помощи определенных алкалоидов, например, колхицина, изучают кариотип набор хромосом, присущий данному организму или виду.


3.Анафаза. Хромосомы разрываются в месте соединения по центромере и хроматиды начинают движение к

противоположным полюсам клетки: от каждой хромосомы одна хроматида движется к одному полюсу, другая — к другому. Хроматиды теперь можно назвать сестринскими хромосомами, т.к. они теперь действительно обретают самостоятельность, становятся самостоятельными хромосомами, которые попадут в разные клетки.

Заканчивается расхождение хроматид к полюсам клетки. Именно на этом этапе клеточного цикла происходит равномерное распределение наследственной информации материнской клетки между дочерними клетками.

4.Телофаза. Хромосомы концентрируются на противоположных полюсах клетки. Начинается десприрализация хромосом, постепенно начинает формироваться ядерная оболочка.


Хроматин


Структурная организация

Нуклеосомиая нить.

Этот уровень организации хроматина обеспечивается четырьмя видами нуклеосомных гистонов: Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Они образуют напоминающие по форме шайбу белковые тела — коры, состоящие из восьми молекул.


Молекула ДНК комплектируется с белковыми корами, спирально накручиваясь на них. При этом в контакте с каждым кором оказывается участок ДНК, состоящий из 146 пар нуклеотидов. Свободные от контакта с белковыми телами участки ДНК называют связующими или линкерными. Отрезок молекулы ДНК длиной около 200 п. н. вместе с белковым кором составляет нуклеосому. Благодаря такой организации в основе структуры хроматина лежит нить, представляющая собой цепочку повторяющихся единиц — нуклеосом.

Вдоль нуклеосомной нити, напоминающей цепочку бус, имеются области ДНК, свободные от белковых тел. Эти области, расположенные с интервалами в несколько тысяч пар нуклеотидов, играют важную роль в дальнейшей упаковке хроматина, так как содержат нуклеотидные последовательности, специфически узнаваемые различными негистоновыми белками.


Хроматиновая фибрилла.

Дальнейшая компактизация нуклеосомной нити обеспечивается пистоном HI, который, соединяясь с линкерной ДНК и двумя соседними белковыми телами, сближает их друг с другом. В результате образуется более компактная структура, построенная, возможно, по типу соленоида. Такая Хроматиновая фибрилла, называемая также элементарной, имеет диаметр 20-30 нм.
Интерфазная хромонема.

Следующий уровень структурной организации генетического материала обусловлен укладкой хроматиновой фибриллы в петли. В их образовании, по-видимому, принимают участие негистоновые белки, которые способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности вненуклеосомной ДНК, отдаленные друг от друга на расстояние в несколько тысяч пар нуклеотидов. Эти белки сближают указанные участки с образованием петель из расположенных между ними фрагментов хроматиновой фибриллы. В результате такой упаковки хроматиновая фибрилла диаметром 20-30 нм преобразуется в структуру диаметром 100-200 нм, называемую интерфазной хромонемой.


Отдельные участки интерфазной хромонемы подвергаются дальнейшей компактизации, образуя структурные блоки, объединяющие соседние петли с одинаковой организацией. Они выявляются в интерфазном ядре в виде глыбок хроматина.


Морфология хромосом


Первичная перетяжка


Хромосомная перетяжка, в которой локализуется центромера и которая делит хромосому на плечи.

Вторичные перетяжки


Морфологический признак, позволяющий идентифицировать отдельные хромосомы в наборе. От первичной перетяжки отличаются отсутствием заметного угла между сегментами хромосомы. Вторичные перетяжки бывают короткими и длинными и локализуются в разных точках по длине хромосомы. У человека это 9, 13, 14, 15, 21 и 22 хромосомы.


Типы строения хромосом


Различают четыре типа строения хромосом


Телоцентрические палочковидные хромосомы с центромерой, расположенной на проксимальном конце

Акроцентрические палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом Субметацентрические с плечами неравной длины, напоминающие по форме букву L Метацентрические V-образные хромосомы, обладающие плечами равной длины.

Типы репарации

Мейоз

Рекомбинация генетического материала

Репарация, типы репарации

План лекции

Формирование новых знаний. Лекционный блок

1.Репарация, типы репарации:

Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации.

Источники повреждения ДНК

УФ излучение

Радиация

Химические вещества

Ошибки репликации ДНК

Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова

Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания

Основные типы повреждения ДНК

Повреждение одиночных нуклеотидов

Повреждение пары нуклеотидов

Разрыв цепи ДНК

Образование поперечных сшивок между основаниями одной цепи или разных цепей ДНК

Устройство системы репарации

Каждая из систем репарации включает следующие компоненты:

фермент, «узнающий» химически изменённые участки в цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения

фермент, удаляющий повреждённый участок

фермент (ДНК-полимераза), синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого

фермент (ДНК-лигаза), замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность

У бактерий имеются по крайней мере 2 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая и эксцизионная.

Прямая репарация

Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

Эксцизионная репарация

Эксцизионная репарация (англ. excision — вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.Полагают, что от 80% до 90% всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК.

Повреждение ДНК, под воздействием факторов окружающей среды, а так же нормальных метаболических процессов, происходящих в клетке происходит с частотой от 1000 до 1000000 случаев в каждой клетке, каждый день.

Благодаря системе репарации из 1000 повреждений ДНК лишь 1 приводит к мутации.

Текст книги «Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие»

1.2.2. Участие корректирующих автономных экзонуклеаз в репликации и репарации ДНК

Корректирующая экзонуклеазная активность не обязательно является частью процессивной ДНК-полимеразы. Достаточно часто в клетке для коррекции новосинтезированной ДНК привлекаются многочисленные автономные экзонуклеазы. Эти экзонуклеазы способны отщеплять неправильный нуклеотид, образуя (или не образуя) комплекс с ДНК-полимеразами.

При синтезе ведущей нити основную роль играют ДНК-полимераза III Е. coli, ошибочность которой составляет 10-6, а у эукариот ДНК-полимеразы ε и δ (ошибочность 10-5). Различные автономные экзонуклеазы способны повышать точность этих процессивных полимераз в 5-10 раз.

При синтезе отстающей нити у Е. соli в объединении фрагментов Оказаки участвует ДНК-полимераза I. Точность этой умеренно процессивной полимеразы резко увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз.

Большинство систем репарации ДНК нуждаются в синтезе ДНК при исправлении ошибок. У Е. соli в репарации ДНК существенное участие принимает ДНК-полимераза I, точность работы которой явно увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз. В клетке человека за сутки образуется в среднем 105 спонтанных повреждений ДНК в результате ее дезаминирования, депуринизации, окисления и неправильного метилирования. Большинство этих повреждений репарируются при участии ДНК-полимеразы β (ошибочность 10-3), В результате этого в транскрибируемой ДНК каждый раунд репликации появляются приблизительно 3 ошибки, подлежащие коррекции. При работе другой системы репарации непроцессивные безнуклеазные сверхошибочные (ошибочность 10-2) ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК в обход повреждений в ДНК-матрице. После завершения синтеза на поврежденной матрице они должны быть заменены, по-видимому, с помощью репликативного фактора С, на основную элонгирующую ДНК-полимеразу δ (ошибочность 10-5). Но в силу той же инерционности биохимических реакций замена не происходит мгновенно, что требует исправления ошибок (совершенных непроцессивными полимеразами напротив неповрежденной матрицы), в том числе с участием автономных экзонуклеаз. В экстрактах клеток человека недавно показана экзонуклеазная коррекция ошибок, допущенных сверхошибочной ДНК-полимеразой η (эта). Наконец, автономные экзонуклеазы участвуют в коррекции гетеродуплексов.

Все виды экзонуклеазной коррекции должны закончиться за время данной репликации. По-видимому, коррекция ДНК-полимеразных ошибок – весьма эффективный процесс, поскольку анализ генома человека показал, что дивергенция последовательностей в транскрибируемой ДНК составляет примерно 0,1 % при исследовании ДНК от 24 человек различных этнических групп.

2. Типы повреждений ДНК

Большинство повреждений ДНК не являются результатом только ошибок репликации. Множество повреждений возникает в любое время клеточного цикла под действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. В табл. 1. схематично изображены основные типы повреждений ДНК, которые опознаются и устраняются различными системами репарации.

Ультрафиолетовые лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, 6,4-фотопродуктов, аддуктов, разрывов и прочие повреждения ДНК. Под действием химических агентов происходят разного рода модификвции нуклеотидов, возникают межнитевые сшивки, конформационные дефекты. Двунитевые разрывы могут приводить к перестройкам хромосом, что и является главной причиной летального действия ионизирующей радиации.

Таблица 1. Основные типы повреждений ДНК.

В результате внутриклеточных процессов в ДНК образуются многочисленные АP-сайты из-за спонтанной утраты пуринов/пиримидинов, окисленные участки (например, 8-оксигуанин), возникающие под действием токсических радикалов, постоянно генерируемых в процессах метаболизма.

Следует заметить, что все повреждения показаны только схематически, так как любое из них вызывает локальное изменение структуры ДНК вокруг, а разрывы ДНК почти всегда сопровождаются и модификацией прилежащих к ним оснований. Кроме обычно упоминаемых пиримидиновых димеров, под действием УФ облучения образуются и другие повреждения, например, 6,4-фотопродукты. В дальнейшем, описывая различные системы репарации ДНК, мы будем подробно останавливаться на тех типах повреждений, которые они способны исправлять.

3. Многообразие систем репарации ДНК

Системы репарации ДНК крайне разнообразны – от простых одноэтапных (фотореактивация, деалкилирование) до сложнейших, многоэтапных механизмов, контролируемых большим числом генов и, включающих соответственно, большое число белков. Этим репарация принципиально отличается от процессов репликации и рекомбинации, обходящихся существенно более ограниченным набором биохимических реакций. Множественность частично перекрывающихся и дополняющих друг друга систем репарации, даже некоторая их избыточность, повышает надежность защиты генома и расширяет возможности обеспечения его работы в онтогенезе и при различных физиологических условиях. Классификация процессов репарации ДНК строится на тех реакциях, которые являются их основой. Выделяются реакции прямой репарации, системы эксцизионной репарации ДНК, репарация с привлечением рекомбинации, пострепликативная репарация, репарация двунитевых разрывов, репаративный обход повреждения, причем иногда один и тот же тип репарации может иметь несколько разных названий. В результате исследований последних лет эта классификация менялась и уточнялась, что мы в дальнейшем будем учитывать.

4. Прямая репарация ДНК

Самый простой и эффективный путь восстановления поврежденных нуклеотидов в составе ДНК – это прямое обращение тех химических реакций, индуцированных химическими или физическими агентами, результатом которых стало данное повреждение. Такой способ устранения повреждений принято называть прямой репарацией. К сожалению, с помощью реакций этого типа может быть исправлено только ограниченное число повреждений. Реакциями прямой репарации являются фотореактивация, репарация с помощью метилтрансфераз (репарация алкилированного гуанина), прямая вставка пуринов инсертазой и прямое зашивание однонитевых разрывов полинуклеотидлигазой.

4.1. Фотореактивация

Фотореактивация – первый из описанных (еще до появления модели ДНК Уотсона и Крика) процессов репарации, поэтому на истории его открытия мы подробно остановимся. Намек на то, что живые клетки способны выживать после действия летальной дозы УФ облучения появляются в научном сообществе чуть раньше середины 1930-годов. Разразившаяся Вторая мировая война задержала открытия этого механизма ДНК-репарации повреждений, возникающих в результате УФ облучения до конца 1940-х, до независимых одновременных наблюдений Альберта Кельнера (эмигранта из Германии), работавшего в группе Милислава Демерека в лаборатории Колд-Спринг-Харбора, и Ренато Дальбекко из лаборатории Сальватора Лурии в университете Индианы. В 1949 году немецкий генетик Альберт Кельнер, бежавший из гитлеровской Германии в США, обнаружил, что в клетках бактерий и грибов, таких, как стрептомицеты и пенициллы, облученных ультрафиолетовым (УФ) светом, а затем перенесенных на видимый свет, частота мутаций падает, а выживаемость резко возрастает по сравнению с клетками, оставленными после облучения в темноте. Кельнер пришел к выводу, что на свету проходят реакции восстановления и какие-то поврежденные молекулы или части их возвращаются к норме. Нужно подчеркнуть, что в 1949 году большинство генетиков еще не понимали ведущей роли ДНК в наследственности, имели весьма смутные представления о структуре хромосом и даже не знали, что дрожжи и другие грибы являются эукариотами. Поэтому объяснение, данное Кельнером восстановлению повреждений на свету, было по-настоящему пионерским. Макс Дельбрюк, другой эмигрант из Германии, будущий Нобелевский лауреат, подсказал Кельнеру название для описанного им явления – фотореактивация. В том же 1949 году сходный процесс был найден независимо Р. Дальбекко у бактериофагов. Ни Кельнер, ни Дальбекко не занимались изучением повреждений ДНК или их репарацией. Они оба использовали УФ-облучение как экспериментальный инструмент и заметили неожиданно высокие уровни выживаемости, когда клетки или бактериофаги (вирусы бактерий) после УФ-облучения в результате лабораторной ошибки во время их исследований в соответствующих лабораториях оказались на свету. Их старания объяснить эти поразительные наблюдения привели к открытию феномена фотореактивациии, когда полученные при облучении УФ-светом ДНК-повреждения репарируются в реакции со светозависимым ферментом.

Кельнер считается первооткрывателем фотореактивации потому, что именно он пришел к выводу, что за процесс исправления ответственна простая реакция в наследственном аппарате. Этот вывод был сделан еще до постулирования существования ДНК в виде двойных спиралей и признания за ДНК функции наследственных молекул.

В этой истории есть еще одно забавное совпадение. Как раз в то самое время, когда Дальбекко наткнулся на фотореактивацию, Уотсон был аспирантом в той же самой лаборатории Лурии и сам в своем диссертационном исследовании занимался эффектами ионизирующей радиации. Удивительно, что всего через 4 года при открытии Уотсоном и Криком структуры ДНК, ни Дальбекко, ни сам Уотсон даже не подумали о репарации ДНК.

Процесс фотореактивации состоит в том, что тиминовые димеры, возникшие в результате УФ-облучения, разрушаются, и тимины возвращаются к своей исходной форме под действием видимого света. Что же такое представляет собой пиримилиновый димер? В 1960 году голландские ученые Р. Бьюкерс и У. Верендс изучили химию процесса повреждения нуклеиновых кислот УФ-светом и выделили продукт, специфический для данного повреждающего агента. Оказалось, что двойная связь между пятым и шестым атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и питозине в ДНК и цитозине и урациле в РНК) под действием УФ-света может рваться. Атомы остаются связанными одиночной связью, а в результате разрыва другой связи образуются две свободные валентности.

Рисунок 2. Схема фотореактивации

Обычно ДНК в клетках находятся в так называемой В-форме, когда плоскости оснований параллельны друг другу и расстояние между плоскостями равно примерно 3,4 А. Это расстояние оказывается как раз таким, чтобы освободившиеся при УФ-облучении валентности между С5=С6 атомами пиримидпновых оснований, расположенных рядом в цепи ДНК, могли замкнуться друг на друга и сформировать более сложное, так называемое циклобутановое кольцо. Если димеризация произошла в РНК, то могут возникнуть димеры урацила и любого другого пиримидинового основания. Довольно часто употребляют и другой термин для их обозначении – пиримидиновые димеры. В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, димерами цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.

Сущность процесса фотореактивации, изображенного на рис. 2, заключается в том, что фермент фотолиаза расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними основаниями и восстанавливает нативную структуру ДНК. В 1963 году фотолиаза E. coli была выделена и очищена. Этот белок кодируется геном phr, а линии с мутациями гена phr имеют дефекты световой репарации.

Все описанные к настоящему времени участвующие в фотореактивации белки относятся к семейству фотолиазкриптохромов. Фотолиазы были найдены у бактерий, дрожжей, дрозофилы, ксенопуса, иглокожих, но не у высших млекопитающих, включая человека. Эти белки являются мономерами с молекулярным весом 55–70 кд, имеющими два нековалентно связанных хроматофора: первый хроматофор это флавин, а второй – фолат (или дезафлавин). Фотолиаза светонезависимым образом (то есть в темноте) связывается с вызванным УФ-облучением повреждением ДНК. Сама же реакции репарации является светозависимой. Фотолиаза может восстанавливать как пиримидиновые димеры, так и (6–4)фотопродукты – другой тип повреждения ДНК, обычно возникающий под действием УФ-облучения. При образовании этого фотопродукта новые связи возникают между 6 и 4 атомами углерода соседних оснований, оно менее устойчиво, чем пиримидиновые димеры, и поэтому не является такой удобной экспериментальной моделью и несколько хуже изучено.

После расщепления связей в поврежденных основаниях и восстановления их формы фотолиаза отходит от ДНК. Прямое восстановление структуры ДНК на этом завершено.

Это единственная пока найденная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Все остальные типы репарации не требуют активации светом и потому первое время носили собирательное название «темновая репарация». Сейчас этот термин практически не встречается.

У человека белки – гомологи фотолиаз участвуют не в процессах репарации, а в регуляции циркадного ритма. Были клонированы гены hCry1, hCry2, mCry1, mCry2 (human/mouse circadian rythm). Эти гены экспрессируются в самых разных тканях – мозгу, печени, яичках, сетчатке и действуют, как циркадные проторецепторы. Вероятно, они являются антагонистами, так как у мышей дефектных по mCry1 циркадные периоды укорачиваются, а у дефектных по mCry2 – напротив, удлиняются. Гены Cry представляют собой очень интересный пример эволюционного изменения функции репарационных генов.

4.2. Репарация О6-алкилированного гуанина

В 1944–1948 годах выдающийся советский генетик И.А. Рапопорт нашел новый класс химических мутагенов, способных добавлять к взаимодействующим с ними молекулам алкильные (метиловые, этиловые, пропиловые, бутиловые) боковые группы, и назвал их алкилирующими агентами. В конце 60-х годов стало ясно, что обработка клеток алкилирующими агентами вызывает, в зависимости от агента N– или О-алкилированние пуринов и пиримидинов, а также трифосфатов. Один из наиболее мощных алкилирующих мутагенов, метил-нитро-нитрозогуанидин, может алкилировать гуанин, присоединяя метальную группу к кислороду, связанному с шестым атомом кольца. Полученный продукт был назван О6-метил-гуанином. В 1978–1979 годах генетики и биохимики обнаружили, что метильная группа может отщепляться от гуанина и тогда происходит прямое восстановление структуры ДНК в этой точке. В 1982–1988 годах было установлено, что такой же механизм функционирует при репарации О4-алкилтимина.

Последующие исследования показали, что в клетках млекопитающих есть целый класс белков метилтрансфераз, которые могут захватывать метальные группы от модифицированного гуанина, переносить их с поврежденного основания на цистеин метилтрансферазы и благодаря этому восстанавливать исходную структуру ДНК. При этом сами метилтрансферазы инактивируются. Например, фермент, кодируемый геном ada (Об-метил-гуанин-трансфераза), распознает Об-метилгуанин в ДНК и удаляет метильную группу, возвращая основание в исходную форму. Репарацией О4-алкилтимина ведает О4-метил-тимин-ДНК-метилтрансфераза. Важно понять, что метилтрансфераза, захватив метильную группу, не может от нее освободиться. Тем самым в прямом смысле метилтрансферазы не являются ферментами, так как настоящие ферменты по определению не изменяются в ходе реакций. Если для каждого акта прямой репарации О6-метилгуанина или О4-алкилтимина нужна новая молекула белка, клетка вынуждена запускать синтез новых его порций. Обычно для обеспечения репарации внутри клетки их накапливается несколько тысяч, по одной молекуле уходит на каждое повреждение. Если процесс возникновения новых повреждений в ДНК идет медленнее, чем синтез новых порций метилтрансфераз, то последних хватает на захват всех метильных групп в гуанинах, и мутации не возникают. Если же скорость внесения новых повреждений превышает скорость синтеза метилтрансфераз, последние перестают справляться со всеми повреждениями, и в клетках накапливаются метилированные основания и предшественники.

В минуту в клетке Е. coli может синтезироваться порядка 100 молекул метилтрансфераз. Следовательно, мутации не возникнут, если скорость возникновения повреждений будет меньше 100 в минуту. Для сравнения: кишечные палочки делятся каждые 30 минут и, таким образом, клетка за один клеточный цикл может накопить не более 3000 метилтрансфераз. У Е. coli устойчивость к алкилирующим агентам связана с 4 генами, ada, alkA, alkB, aidB, но только ген ada вовлечен в репарацию О6-метилгуанина.

Необходимо отметить, что О6-алкилгуанины являются одними из самых значимых повреждений, несмотря на то, что их общее количество среди всех повреждений ДНК, вызванных алкилированием меньше 8 %. В основном это О6-метилгуанин и О6-этилгуанин, основания, способные к неправильному спариванию и являющиеся основной причиной возникновения транзиций GC-AT. К тому же именно эти повреждения не удаляются другими системами репарации, например, эксцизионной репарацией оснований (base excision repair, BER), а при действии другой эксцизионной системы репарации – репарации неспаренных оснований(missmath repair, MMR), приводят к возникновению двунитевых разрывов. Другим столь же серьезным предмутационным алкилированным основанием является появляющийся крайне редко О4-метилтимин, – всего менее 0.4 % среди всех вызванных алкилированием повреждений. То есть в случае двух данных повреждений при инактивации или подавлении их прямого восстановления с участием метилтрансфераз, другие системы репарации окажутся бесссильны.


Рисунок 3. AGT человека (А – схема всего белка, Б – схема его активного центра)

В человеческих клетках О6-алкилированные повреждения могут быть восстановлены в прямой реакции О6-метилгуанин-ДНК– метилтрансферазой (MGMT, ATase, AGT,AGAT), которая является гомологом продукта гена ada (ADA) E.coli, структура которой изображена на рис. 3.

С-концевой домен (остатки 86-207) содержит консервативный активный сайт с цистеиновым мотивом (IPCHRV), канал для связывания 06-алкилгуанина и ДНК-распознающий мотив спираль-поворот-спираль (Н6), работающий благодаря его внедрению в глубокую бороздку ДНК.

Гуанин «втаскивается» внутрь активного канала вдоль распознающей спирали. Гуанин-специфические водородные связи устанавливаются между белком и ДНК.

Человеческий MGMT ген картирован на 10q26 и кодирует белок с молекулярным весом в 24 кД, состоящий из 207 аминокислотных остатков. Этот белок переносит метил или хлорэтил из поврежденного гуанина на остаток цистенина в своем активном центре. Активность MGMT была измерена в различных тканях человека, как нормальных, так и опухолевых и было показано, что его экспрессия, особенно в опухолевых тканях, может быть различной. Клетки, дефектные по этому гену, не способны к репарации О6-алкилгуанина, в них резко повышен уровень мутаций, вызываемых алкилирующими агентами, сестринских хроматидных обменов и хромосомных аберраций. Мыши, нокаутные по MGMT жизнеспособны, но у них резко повышено количество спонтанно возникающих опухолей и они чувствительны к действию алкилирующих агентов. Напротив, у мышей с оверэкспрессией MGMT спонтанные опухоли развиваются значительно реже, чем у контрольных. MGMT был первым геном млекопитающих, у которого была показана экспрессия, индуцированная действием генотоксического стресса и глюкокортикоидов, приводящая к адаптивному ответу клетки на мутагенное и токсическое действие простых алкилирующих агентов.

Экспрессия MGMT регулируется метилированием как самого гена, так и его промотора, причем метилирование промотора приводит к ее ингибированию, а метилирование самого гена к повышению экспрессии MGMT. С метилированием MGMT также связана повышенная устойчивость клеток меланомы к действию хлорэтиловых антиопухолевых препаратов.

4.3. Репарация однонитевых разрывов ДНК

Еще один тип реакций прямой репарации был обнаружен для однонитевых разрывов ДНК, индуцируемых, например, ионизирующим излучением. При этом с помощью фермента ДНК полинуклеотидлигазы (от англ. ligase – соединять, связывать) происходит прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК. Здесь у нас есть возможность немного подробнее остановиться на роли лигаз в клетке. ДНК лигазы являются важными ферментами метаболизма ДНК. Они катализируют реакцию объединения концов ДНК, необходимую для репликации ДНК и для тех путей репарации, при которых есть репаративный синтез. У большинства организмов лигазы используют энергию АТФ, и лишь у эубактерий – энергию НАД(+). Интересно, что несмотря на различия в аминокислотных последовательностях и биохимических реакциях между этими двумя классами лигаз, структура аденилирующего домена у них совершенно одинакова.

Полинуклеотидлигаза является основным ферментом у E.coli, а высшие организмы производят несколько различных лигаз, имеющих специфические мишени и функции. Лигаза I необходима для сшивания фрагментов Оказаки и некоторых репарационных реакций, лигаза II не является отдельным самостоятельным ферментом, а появляется как продукт деградации лигазы III, ДНК лигаза III имеет несколько изоформ, вовлеченных в процессы репарации и рекомбинации, а ДНК лигаза IV необходима для V(D)J рекомбинации и негомологичного соединения концов ДНК при воссоединении двунитевых разрывов. Изучение аминокислотной последовательности и структурный анализ показали, что все лигазы построены вокруг общего каталитического кора, подобного таковому у лигазы бактериофага Т-7, структура которого до сих пор недостаточно ясна.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *